用作益生菌的细菌菌株、其组合物、保藏菌株和鉴定益生菌细菌菌株的方法技术

本发明专利技术涉及细菌菌株或细菌菌株的组合，用于作为鱼中的益生菌的用途，其选自如下：马氏金黄杆菌菌株；黄杆菌属种菌株，与基因组包含SEQ ID NO：1或2020年1月24日保藏于法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)的通过登录号No.I

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作益生菌的细菌菌株、其组合物、保藏菌株和鉴定益生菌细菌菌株的方法


[0001]本专利技术涉及益生菌领域，特别是以细菌菌株的形式作为活性成分用作益生菌或适用于设计向鱼施用的益生菌组合物。因此，本专利技术涉及使用这类活性成分处理所述鱼，以对它们的健康起到预防和/或有益的效果。本专利技术的活性成分特别显示出有益于对抗柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)细菌的感染挑战。本专利技术还涉及鉴定益生菌细菌菌株的方法。

技术介绍

[0002]动物常驻微生物联合体形成复杂且长期的关联，发挥着对宿主的发育和生理不可或缺的重要群落水平功能[1，2]。微生物群生态系统还通过抑制病原体的定居和生长和/或刺激宿主免疫系统的组合来提供针对外源病原体的保护[3
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7]。从微生物群落组成的角度，常居微生物多样性的变化或减少，该现象通常被称为生态失调，通常与关键微生物群落成员丰度的大量减少或变化导致的感染易感性增加有关[7，8]。这些观察结果早期支持了如下观点：添加或促进单独保护性或群落保护性细菌(例如益生菌)可以最小化微生物群的生态失调或直接预防感染以恢复宿主健康[9
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11]。
[0003]尽管益生菌的功效已在动物和人类中得到证实，但对其作用机制知之甚少，多样性调查或低通量实验模型提供的关于菌种对群落功能的贡献的信息有限[1，6，12
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14]。此外，改善定殖抗性的细菌菌株的表征仍然受阻于宿主共生生态系统的复杂性。最近斑马鱼成为研究微生物
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微生物和宿主
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微生物相互作用的有力工具[15
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20]。斑马鱼可以容易地进行无菌饲养或与特定细菌物种联合进行悉生饲养[15，21]。此外，斑马鱼细菌群落越来越充分地被表征，并且可以培养大量的系统发生不同的斑马鱼肠道细菌，使该模型系统可直接进行微生物群操作和评估益生菌对宿主抗感染性的影响[22
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25]。若干研究已经使用斑马鱼来评估外源添加的潜在益生菌对宿主抗感染性的影响[23
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25]。然而，尽管各种乳酸细菌(乳酸杆菌属种(Lactobacilli spp.)、芽孢杆菌属种(Bacillus spp.))已被证明可以改善针对许多斑马鱼病原体(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维罗尼气单胞菌(A.veronii)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus))的感染结果[26
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30]，但报告的保护作用往往是部分的，这体现了鉴定完全保护性外源益生菌的困难。
[0004]专利技术人使用无菌斑马鱼和常规斑马鱼幼体来发掘固有的共生微生物群，以获得防御柱状黄杆菌(一种影响野生和养殖鱼种(包括鲤鱼、斑点鲶鱼、金鱼、鳗鱼、鲑鱼和罗非鱼)的拟杆菌病原菌)的细菌物种[31，32]。他们鉴定了两种防止由柱状黄杆菌引起的死亡的抗感染性情况，其由拟杆菌细菌马氏金黄杆菌(Chryseobacterium massiliae)或由9种其他形成保护性群落的非保护性细菌物种的集合介导。他们的结果构成了发掘宿主微生物群和鉴定介导定殖抗性的关键成员的有力方法，为如何设计微生物群落以防御水产养殖环境及其他环境中的病原体提供了见解。
[0005]事实上，尽管野生鱼存量正在接近生物学上不可持续的极限，但鱼类水产养殖是一个快速发展的行业，提供了超过一半的食用鱼[101]。然而，集约化水产养殖促使病原体爆发，水产养殖设施的高死亡率构成了鱼类生产的重要瓶颈[102
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104]。这些健康问题主要影响免疫方面未成熟的幼鱼幼体，对其接种疫苗是不切实际的[105，106]，这促使预防性和治疗性地使用抗生素和化学消毒剂来预防鱼类疾病[107
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109]。然而，抗生素和化学消毒剂的广泛使用与最终消费者的安全风险、环境污染和引起了广泛人类健康关注的抗生素抗性的传播有关[104，110]。在这种情况下，使用益生菌来改善鱼类健康和保护易于被疾病感染的幼鱼似乎是一种经济上和生态上合理的抗生素治疗的替代策略[111
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113]。
[0006]益生菌是活的微生物，其通过包括促进生长、免疫刺激或直接抑制病原微生物在内的机制赋予宿主健康益处[114
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116]。考虑到宿主微生物群针对病原微生物的重要保护性作用(该过程被称为定殖抗性)[117
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119]，鱼类相关微生物群落被认为是感兴趣的益生菌来源[120
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122]。事实上，胃肠道和鱼类粘液是潜在鱼类益生菌的最常见来源[123，124]。然而，益生菌的选择通常是经验性的，或因体内挑战缺乏可重复性和再现性而受到阻碍，其通常在相对差的控制条件和高个体间微生物组成情况下进行[121，125]。
[0007]为了规避与基于证据的鱼类益生菌鉴定相关的实验困难，使用无菌的或完全控制的悉生宿主是一种有前途的策略[126，127]，已在无菌条件下成功养殖了几个具有重要经济意义的鱼种，包括大西洋鳕鱼(Gadus morhua L.)[128]、大西洋大比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)[129]、欧洲海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)[125]或大菱鲆(Scophthalmus maximus)[130](相关综述参见[131，132])。其他研究使用无菌或悉生饲养的实验室斑马鱼(Danio rerio)来评估添加外源性益生菌对宿主感染的影响[133
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136]。然而，在大多数情况下，测试的益生菌对于宿主而言是外源性的并且是短期的微生物群居住者，只能针对测试的病原体提供部分保护。
[0008]因此，专利技术人研究了虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)微生物群成员防御柱状黄杆菌感染(一种导致水产养殖鱼种(尤其是鲶鱼和鲑鱼)大量损失的鱼类病原体)的潜力[137]。利用一种在无菌条件下饲养鳟鱼幼体的新方案，他们表明无菌、但非传统的鳟鱼幼体对柱状黄杆菌的感染极为敏感。之后，他们使用无菌鳟鱼的再常规化来鉴定源自鳟鱼(黄杆菌属种(Flavobacterium sp.))或斑马鱼(马氏金黄杆菌(Chryseobacterioum massiliae))微生物群的细菌物种，其中这些微生物群完全恢复了针对柱状黄杆菌感染的防御。他们的研究结果表明，他们的新的悉生鳟鱼模型使得对硬骨鱼类微生物群的发掘能够合理地鉴别鱼类益生菌，这些益生菌可以单独地或联合地在水产养殖研究和畜牧业的背景下帮助防止虹鳟鱼和其他鱼类的柱状病(columnaris disease)。
[0009]因此，本专利技术依靠本文所述的实验，提出了解决上述问题的新手段和工具。特别是，本专利技术涉及提供用于保护鱼类抵抗病原体及其有害影响的相关益生菌材料。

技术实现思路

[0010]因此，本专利技术涉及细菌菌株或细菌菌株的组合，用于作为鱼或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.细菌菌株或细菌菌株的组合，用于作为鱼中的益生菌的用途，其中，所述细菌菌株或所述组合中的至少一种细菌菌株选自如下：马氏金黄杆菌菌株；马氏金黄杆菌菌株，其中一种以上毒力因子编码基因和/或抗生素抗性基因缺失或失活；黄杆菌属种菌株，所述黄杆菌属种菌株的基因组与SEQ ID NO：1具有至少95％以上的平均核苷酸同一性(ANI)或所述黄杆菌属种菌株与2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5481识别的黄杆菌属种菌株具有至少95％的ANI；以及黄杆菌属种菌株，所述黄杆菌属种菌株的基因组与SEQ ID NO：1具有至少95％以上的平均核苷酸同一性(ANI)或所述黄杆菌属种菌株与2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5481识别的黄杆菌属种菌株具有至少95％的ANI，其中一种以上毒力因子编码基因和/或抗生素抗性基因缺失或失活；其中，可选地，在包含不同细菌菌株的混合物的单一组合物或单独的组合物中，所述细菌菌株与可接受的载体或递送媒介和可选的佐剂组分联合。2.根据权利要求1所述的细菌菌株或细菌菌株的组合，用于根据权利要求1的用途，其中：a.当仅使用一种细菌菌株时，所述细菌菌株在没有可接受的载体或递送媒介的情况下或在权利要求1所述的组合物中被施用给有需要的鱼；或者b.当使用不同细菌菌株的组合时，所述细菌菌株以如下方式施用给有需要的鱼：i.在没有可接受的载体或递送媒介的情况下，作为单独的细菌菌株；或ii.作为单一组合物中的不同细菌菌株的混合物；或iii.在不同组合物中，所述组合物各自包含至少一种细菌菌株；或iv.作为至少一种个体化的细菌菌株和不同组合物的连用，所述组合物各自包含至少一种细菌菌株；当使用不同细菌菌株的组合时，所述细菌菌株被同时或以任何顺序单独地或以任何顺序依次施用给有需要的宿主。3.根据权利要求1至2中任一项所述的细菌菌株或细菌菌株的组合，用于根据权利要求1至2中任一项的用途，其中，所述细菌菌株选自如下细菌菌株：
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分别地，基因组与SEQ ID NO：2具有至少96％以上的平均核苷酸同一性(ANI)的细菌菌株，或与2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5479识别的马氏金黄杆菌菌株具有至少96％的ANI的细菌菌株，和/或基因组与SEQ ID NO：1具有至少96％以上的平均核苷酸同一性(ANI)的细菌菌株，或与2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5481识别的黄杆菌属种菌株具有至少96％的ANI的细菌菌株；和/或
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包含16S rDNA序列的细菌菌株，所述16S rDNA序列分别与基因组包含SEQ ID NO：2的马氏金黄杆菌菌株、或2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5479识别的菌株、或基因组包含SEQ ID NO：1的黄杆菌属种菌株、或2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5481识别的菌株中存在的16S rDNA序列具有至少97％的序列同一性；和/或
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来自如下的细菌菌株：基因组包含SEQ ID NO：2的马氏金黄杆菌菌株或2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5479识别的菌株，以及基因组包含SEQ ID NO：1的黄杆菌属种菌株或2020年1月24日保藏于CNCM的通过登录号No.I
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5481识别的菌株；和/或
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这些菌株中任一种的变体，其中一种以上毒力因子编码基因和/或抗生素抗性基因缺失或失活。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌菌株或细菌菌株的组合，用于根据权利要求1至3中任一项的用途，其中，所述至少一种细菌菌株被施用给：a.宿主，所述宿主为硬骨鱼，更特别是虹鳟鱼，尤其是它们的幼体，或b.宿主，所述宿主包含同源鱼群或混合鱼群，或基本上由同源鱼群或混合鱼群组成，或由同源鱼群或混合鱼群组成，例如包含处于它们的发育或生长的不同阶段的鱼(例如虹鳟鱼)的群。5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌菌株的组合，用于根据权利要求1至4中任一项的用途，其中，所述组合还包含处理的鱼种的固有微生物群的至少一种其他细菌菌株。6.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌菌株或细菌菌株的组合，用于根据权利要求1至5中任一项的用途，其中，组合物基本上由至少一种细菌菌株以及可接受的载体或递送媒介和可选的佐剂组分组成，或由至少一种细菌菌株以及可接受的载体或递送媒介和可选的佐剂组分组成，所述至少一种细菌菌株优选为活细菌菌株或易于复苏的菌株。7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌菌株或细菌菌株的组合，用于根据权利要求1至6中任一项的用途，用于：a.在宿主鱼或处理的宿主鱼群中预防或最小化柱状黄杆菌的感染，或增强处理的宿主鱼或处理的...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：