一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术首先利用超速离心法对外膜囊泡进行粗提取，获得粗提外膜囊泡，再制作碘克沙醇密度梯度溶液，利用密度梯度法对粗提的外膜囊泡进行纯化，最终得到纯化的外膜囊泡。本发明专利技术将超速离心技术和碘克沙醇密度梯度离心技术相结合，有效解决了具核梭杆菌外膜囊泡提取量少、毒性杂质存留的问题。细胞实验结果表明，本发明专利技术纯化的具核梭杆菌外膜囊泡对人正常结直肠上皮细胞毒性低，同时能促进其释放促炎因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用。

技术介绍

[0002]近年来，结直肠癌严重影响人类身体健康。结直肠癌最常用的预防策略是化学预防，如服用阿司匹林和其他非甾体抗炎药，然而长期使用阿司匹林(或其他非甾体抗炎药)会导致不良反应，包括胃出血、腹痛、消化不良、恶心和呕吐等，并且还会产生耐药性，因此迫切需要更为安全的替代方法。研究表明，具核梭杆菌与结直肠癌的发生和转移直接相关，因此，基于免疫方法控制、减少或根除具核梭杆菌在肠道的定植可有效预防结直肠癌的发生与发展。
[0003]细菌外膜囊泡(OMVs)是由细菌分泌产生的脂双层近球形膜囊泡，大小为10～300nm，其组成成分包括外膜蛋白、脂多糖、周质蛋白、内膜蛋白、核酸及肽聚糖等。OMVs中的脂多糖、蛋白质、毒力因子以及遗传物质等在细菌侵染过程中发挥了重要作用，包括促进发病、使细菌在应激条件下存活、向临近细胞传递遗传物质以及调节细菌群落相互作用等。由于细菌外膜囊泡自身的结构与特性，使其在疫苗开发方面具备诸多潜力。一是其表面存在多种抗原，可降低病原体引发的，疫苗中靶抗原发生突变的可能性，进而降低疫苗产生逃逸变体的可能性；二是外膜囊泡具有内在佐剂的能力，相较于传统佐剂，外膜囊泡佐剂具有安全性高、能够引起全面免疫等特点；三是外膜囊泡可作为粘膜转运蛋白，将抗原转运至粘膜屏障；四是外膜囊泡没有生命力且不能复制，具有安全性。此外，外膜囊泡分离成本相对较低，可大大降低疫苗生产成本。因此，外膜囊泡已成为疫苗开发的热门研究对象。例如，基于野生型脑膜炎奈瑟球菌外膜囊泡的疫苗已用于临床，用于预防脑膜炎球菌病。
[0004]基于外膜囊泡的生物学功能，其临床应用前景可期。但有关具核梭杆菌外膜囊泡的相关研究较少，对于具核梭杆菌外膜囊泡在人结直肠癌的预防和治疗方面的研究更是鲜有耳闻。并且目前对细菌外膜囊泡提取的方法多为超速离心法，这种方法分离得到的外膜囊泡数量较少，且含有鞭毛和细胞碎片等杂质，导致提取的外膜囊泡质量较差，细胞毒性较大。因此，建立一种能够快速获得大量低毒外膜囊泡的提取和纯化技术是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]为解决传统结直肠癌化学预防的缺陷以及原有外膜囊泡提取方法产量低、毒性大、杂质多的问题，本专利技术提供了一种具核梭杆菌外膜囊泡及其提取纯化方法及应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术技术方案一：一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法，包括以下步骤：
[0008]a.取具核梭杆菌菌种进行培养，获得菌液；
[0009]b.取菌液第一次离心，过滤得上清液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液第二次离心，去
掉上清液，重悬沉淀后获得粗提的外膜囊泡；
[0010]c.制作碘克沙醇密度梯度离心液，浓度由上至下依次增大，最上层加入粗提的外膜囊泡，进行密度梯度离心纯化，即得纯化后的外膜囊泡。
[0011]碘克沙醇密度梯度离心的原理是，利用缓冲液将碘克沙醇稀释到不同浓度，不同浓度溶液具有不同密度。粗提液中含有多种组分，包括外膜囊泡、细菌细胞碎片、细菌鞭毛等，这些组分也具有不同的密度。离心过程中，在离心力的作用下，密度不同的颗粒将沉降到与其密度相等的离心液中，收集外膜囊泡聚集区域的离心液，去除离心液后，得到外膜囊泡。
[0012]进一步地，步骤a中所述培养为将具核梭杆菌菌种加入到30mLTSB培养基中，37℃培养9h，获得种子液；取330mLTSB培养基，按1％接种种子液，充氮气5min，37℃培养40h。
[0013]进一步地，步骤b中所述过滤为将上清液通过0.22μm水系膜过滤；所述浓缩为利用中空纤维膜浓缩滤液。
[0014]进一步地，步骤b中所述第一次离心为4℃，8500rpm离心25min；所述第二次离心为4℃，200000
×
g离心4h。
[0015]进一步地，步骤c中所述碘克沙醇密度梯度离心液的具体制作方法为将碘克沙醇离心液用含0.85wt％NaCl的30mMHEPS缓冲液稀释，分别得到质量浓度为40％、35％、30％、25％、20％、15％的稀释液。
[0016]本专利技术技术方案二：一种具核梭杆菌外膜囊泡。
[0017]本专利技术技术方案三：一种所述的具核梭杆菌外膜囊泡在制备促进释放促炎因子药物中的应用。
[0018]进一步地，所述促炎因子包括白细胞介素IL
‑
8。
[0019]本专利技术技术方案四：一种所述的具核梭杆菌外膜囊泡在制备降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞黏附作用的药物中的应用。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0021](1)本专利技术首先对具核梭杆菌菌液进行超速离心，得到粗提取的外膜囊泡后利用碘克沙醇密度梯度离心技术进行纯化。将超速离心技术和碘克沙醇密度梯度离心技术相结合，有效解决了具核梭杆菌外膜囊泡提取量少、毒性杂质存留的问题。
[0022](2)本专利技术提取的外膜囊泡与传统方法相比纯度更高，蛋白质含量更高。
[0023](3)本专利技术提取的具核梭杆菌外膜囊泡对人正常结直肠上皮细胞毒性较低，且能够促进其细胞促炎因子IL
‑
8的分泌，为其在制备促进释放促炎因子药物以及疫苗开发方面的应用提供技术基础。
[0024](4)本专利技术提取的具核梭杆菌外膜囊泡可有效引起新西兰大白兔的免疫反应，利用其制备的抗体能够显著降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞的黏附。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为具核梭杆菌分泌外膜囊泡扫描电镜图；
[0027]图2为纯化外膜囊泡SDS
‑
PAGE电泳图，M表示Maker；1
‑
9分别表示梯度离心得到的9管分装液；
[0028]图3为实施例1纯化的膜囊泡对HCoEpiC细胞毒性检测结果；
[0029]图4为对比例1获得的外膜囊泡对HCoEpiC细胞毒性检测结果；
[0030]图5为实施例1纯化外膜囊泡透射电镜图(左)和对比例1纯化外膜囊泡透射电镜图(右)，右图中箭头标注为存在的杂质；
[0031]图6为实施例1纯化的外膜囊泡对HCoEpiC细胞释放促炎因子IL
‑
8的影响；
[0032]图7为对比例1获得的外膜囊泡对HCoEpiC细胞释放促炎因子IL
‑
8的影响；
[0033]图8为新西兰大白兔血清P/N值随时间变化情况；
[0034]图9为利用外膜囊泡制备的抗体对具核梭杆菌粘附结肠癌细胞的影响。
具体实施方式
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：a.取具核梭杆菌菌种进行培养，获得菌液；b.取菌液第一次离心，过滤得上清液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液第二次离心，去掉上清液，重悬沉淀后获得粗提的外膜囊泡；c.制作碘克沙醇密度梯度离心液，浓度由上至下依次增大，最上层加入粗提的外膜囊泡，进行密度梯度离心纯化，即得纯化后的外膜囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述培养为将具核梭杆菌菌种加入到30mLTSB培养基中，37℃培养9h，获得种子液；取330mL TSB培养基，按1％接种种子液，充氮气5min，37℃培养40h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述过滤为将上清液通过0.22μm水系膜过滤；所述浓缩为利用中空纤维膜浓缩滤液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述第一次离心为4℃，8500rpm离心25min；所述第二次离心为4℃，2...

【专利技术属性】
技术研发人员：权春善，张丽影，张旭强，郑维，王豫鑫，范若辰，葛树爱，吴亚芳，胡展驰，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：