一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体及其制备方法和应用，属于单克隆抗体制备技术领域。本发明专利技术提供的塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体的制备方法，从感染和免疫SVA抗原的猪外周血中，利用单个B细胞抗体技术，获得SVA抗体IgG基因序列，并在真核细胞中表达和组装，获得SVA特异性猪源单克隆基因工程抗体，然后利用ELISA、病毒中和实验和免疫荧光实验验证筛选出SVA高亲和力的特异性猪源单克隆基因工程抗体，对研究SVA宿主特异性抗原位点的鉴定提供了重要方法，也为该病毒的新型疫苗设计和诊断方法的建立提供了关键技术材料。料。料。

【技术实现步骤摘要】
一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于单克隆抗体制备
，具体涉及一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员。该病毒感染可引起猪的鼻镜和蹄冠出现水疱、溃烂、跛行甚至死亡(新生仔猪致死率高达(30％～70％)
[1]，临床上与其它水疱病如口蹄疫病毒、猪水泡病毒、水泡性口炎病毒、猪水疱疹病毒难以区分，已对养猪业的生产和经济效益具有重大的潜在威胁。目前，美国、加拿大、巴西、泰国、中国、越南等多个国家局部暴发了SVA疫情，且各国之间的流行毒株同源性极高
[2,3]，有些毒株已发生了重组和变异
[4]。因此，许多国家都监视本病的发生和发展，加紧开发防治技术产品。
[0003]目前，SVA的病原学检测主要依赖RT-PCR方法或者实时荧光定量RT-PCR方法，血清学仍然使用传统的间接ELISA或者竞争ELISA方法、中和试验以及间接免疫荧光试验。随着养殖业的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用塞内卡病毒株感染猪，21d后用所述塞内卡病毒株制备的灭活疫苗免疫猪，免疫后21～30d采集猪外周血，分离PBMCs；2)将所述PBMCs进行流式细胞分选，分选出IgG
+-SVA
+
细胞；3)以所述IgG
+-SVA
+
细胞的基因组为模板反转录，得到单细胞cDNA；4)将所述单细胞cDNA为模板进行巢式PCR扩增，得到猪IgG重链可变区的基因和轻链可变区的基因；5)将所述猪IgG重链可变区的基因和轻链可变区的基因分别构建IgG重链表达载体和IgG轻链表达载体；6)将所述IgG重链表达载体和IgG轻链表达载体共转染真核细胞进行重组表达，分离重组蛋白得到塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述塞内卡病毒株为SVA/HN/11/2017兰兽研，保藏编号为CGMCC NO.19966；所述SVA/HN/11/2017兰兽研的毒价为1
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/mL；所述SVA/HN/11/2017兰兽研的免疫剂量为2mL/头。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中将所述PBMCs进行流式细胞分选前，包括对所述PBMCs进行流式细胞染色；所述流式细胞染色的方法，将PBMCs与生物素标记的SVA病毒粒子抗原和抗猪IgG-FITC荧光抗体混合孵育，洗涤后重悬，加入Anti-biotin-APC二抗冰浴，重复洗涤后重悬，得到染色的PBMCs。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4)中猪IgG重链可变区的巢式PCR扩增引物组包括内引物对和外引物对；所述外引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述内引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；轻链可变区的巢式PCR扩增引物组包括λ轻链巢式PCR扩增引物组和κ轻链巢式PCR扩增引物组；所述λ轻链巢式PCR扩增引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7的λV3外引物、核苷酸序列如SEQ ID No.8的λV2-6外上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.9的λV8外上游引物、核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：马雪青，孙普，李坤，李平花，卢曾军，刘在新，付元芳，白兴文，曹轶梅，张婧，祁光宇，李冬，包慧芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：