抗VEGFR2单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗体药物领域，本发明专利技术公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人VEGFR2单克隆抗体，并公开了包含编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及用途。本发明专利技术所述单克隆抗体通过结合VEGFR2，阻断VEGF与VEGR2结合，不再诱发受体二聚化，以及后续的胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化和激活下游信号通路，包括激活磷脂酶C，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终阻断由于VEGF结合VEGFR2并诱导其二聚化而引起血管增生。本发明专利技术所述单克隆抗体可用于治疗由肿瘤新生血管引起的疾病。

Anti VEGFR2 monoclonal antibody and its application

The invention belongs to the field of antibody drug, the invention discloses a screening and genetic engineering preparation method by phage antibody library technology human anti human VEGFR2 monoclonal antibody, vectors, host cells containing the monoclonal antibody and uses encoding polynucleotide and publicly. The inventive monoclonal antibody by combining VEGFR2, VEGF and VEGR2 block with no longer induced receptor dimerization, and tyrosine phosphorylated residues following intracellular tyrosine kinase domain and activation of downstream signaling pathways, including activation of phospholipase C, increased intracellular calcium ion concentration, including induced vascular endothelial cell proliferation and survival, cytoskeleton rearrangement, cell migration, gene expression, eventually blocking due to VEGF binding and induced dimerization of VEGFR2 caused by vascular proliferation. The monoclonal antibodies of the present invention can be used to treat diseases caused by tumor neovascularization.

【技术实现步骤摘要】
抗VEGFR2单克隆抗体及其应用本申请要求于2017年1月25日提交中国专利局、申请号为201710060867.X、专利技术名称为“抗VEGFR2单克隆抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本专利技术属于抗体药物领域，具体涉及全人源抗VEGFR2单克隆抗体及其应用。
技术介绍
血管新生是指已存的血管(毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式产生新的血管，其在许多生理过程中发挥重要作用，如胚胎发生、伤口愈合、炎症反应和月经等。同时，血管新生在一些病理过程中同样扮演重要角色，如失控的血管新生是肿瘤增殖及转移的主要原因。血管新生也和糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎及银屑病等其他疾病密切相关。所以抑制血管新生成为治疗这些疾病的可行方法。在血管新生过程中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)起着重要作用，能强烈地刺激血管内皮细胞增殖。VEGF结合的受体包括VEGFR1(也被称作Flt-1)和VEGFR2(也被称作Flk-1)。VEGFR1和VEGFR2属于III型受体酪氨酸激酶家族，胞外区由7个免疫球蛋白样结构域组成，含配体结合域和受体二聚化结构域，中间包含一个细胞跨膜区，胞内含有一个酪氨酸激酶结构域。VEGFR2介导VEGF的多种效应，包括内皮细胞增殖、血管增生和渗透，而VEGFR1似乎并没有直接参与内皮细胞增殖和血管增生。VEGF二聚体结合VEGFR2后诱发受体二聚化，胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化，从而激活下游信号通路，包括激活磷脂酶C，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终引起血管增生。因此，VEGF及VEGFR2是很好的治疗靶点，抑制该信号通路理论上能够抑制血管新生，从而治疗血管新生相关的疾病。美国FDA于2004年批准靶向VEGF的抗体贝伐单抗(Avastin)，该药在临床与化疗药物联合治疗结肠癌时可明显延长病人生命，但因同时抑制了VEGF的正常生理功能，病人使用后出现高血压、出血、血栓形成等副反应。鉴于VEGFR2在VEGF信号通路中的重要作用，抑制VEGFR2也是一种抑制血管新生的策略。相对于VEGF而言，靶向VEGFR2的药物针对性更强，安全性更好。FDA于2014年批准上市的Ramucirumab(IMC-1121B)就是靶向VEGFR2的抗体药物。抗体是由抗原刺激机体后所形成的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白(immunoglobubin，Ig)。已知有IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等5类免疫球蛋白，普遍存在于生物体内的血液、体液、外分泌液及某些细胞(如淋巴细胞)的细胞膜上。作为生物药物的重要组成部分，抗体已经成为类别最大且发展最快的生物药物。而单克隆抗体更是由于其针对靶点的高度特异性而在临床上成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。在抗体药物发展初期，鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用，但由于其是鼠源的，在病人中引发了严重的免疫反应，严重阻碍了抗体药物的发展。随着抗体人源化技术的发展，抗体药物产业化的瓶颈被打破。目前临床上使用的治疗性单克隆抗体包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体及全人源抗体，其中全人源单克隆抗体由于高度的亲和力及低免疫原性备受青睐。全人源的单克隆抗体可通过噬菌体展示技术、核糖体展示技术、抗体人源化小鼠技术等方法获得。其中，抗体的噬菌体展示技术(PDT)是将抗体V区片段融合噬菌体表面蛋白(g3)后展示到噬菌体表面，然后针对不同抗原对噬菌体库进行筛选，最终得到特异的抗体。该技术模拟了机体的免疫筛选，从人工建立的噬菌体文库中筛选得到抗体。抗体噬菌体展示技术除了能筛选针对不同抗原的特异抗体外，还能对抗体进一步突变高变区而提高其抗原亲和力。尽管已经通过上述技术获得了一些在治疗上有很大优势的人源化单克隆抗体，但是筛选出具有所需性质和功能的人源化单克隆抗体绝非易事，现实中依然存在对这类人源化单克隆抗体的迫切需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供全人源抗人VEGFR2单克隆抗体，编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本专利技术涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子作为药物用于临床上由于新生血管生成所导致的适应症的使用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术通过噬菌体展示技术筛选针对VEGFR2的人源化抗体，并利用基因工程方法得到完整抗体，从而提供用于治疗血管新生相关疾病的药物。具体的抗体的制造及相关检测方法如下：通过提取不同人的外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录成cDNA，然后用简并引物进行抗体可变区基因的扩增，并酶切连接到噬菌体展示载体pCANTAB5E，克隆转化到可用于噬菌体展示的TG1细胞，构建出108的人重链可变区和轻链可变区组合的单链抗体库；通过噬菌体展示技术将单链抗体展示在噬菌体表面，再以VEGFR2抗原进行淘选、富集，筛选大量和VEGFR2抗原结合的单链抗体基因；然后将单个的单链抗体进行诱导表达，并使用VEGFR2进行ELISA筛选，筛选出和VEGFR2结合的全新人源抗体重链可变区；然后构建转换成全长IgG抗体，使用瞬时转染、培养和少量亲和纯化(ProteinA)制备少量纯化抗体，以细胞毒功能测试(ADCC、CDC和凋亡实验)进行筛选鉴定。在经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子，再对这些抗体可变区特别是CDRs区序列检索，确定该组具备VEGFR2特异性的细胞毒功效的抗体为首次发现的新分子。本专利技术所述方法构建了高容量高多样性抗体库，从大容量抗体库中筛选出和VEGFR2结合且能阻断其与配体VEGF结合的抗体，且筛选出的抗体具有细胞活性。本专利技术所述抗人VEGFR2单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区：(Ⅰ)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo:1-6任一项所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；和/或(Ⅱ)所述轻链可变区的氨基酸序列，如SEQIDNo:7-12任一项所示；者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述抗VEGFR2单克隆抗体具有：(ⅰ)氨基酸序列为SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:7的轻链可变区；或(ii)氨基酸序列为SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:8的轻链可变区；或(ⅲ)氨基酸序列为SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:9的轻链可变区；或(ⅳ)氨基酸序列为SEQIDNO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQIDNO:10的轻链可变区；或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗VEGFR2的单克隆抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：(Ⅰ)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:1‑6任一项所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；和/或(Ⅱ)所述轻链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No:7‑12任一项所示；者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2017.01.25 CN 201710060867X1.一种抗VEGFR2的单克隆抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：(Ⅰ)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo:1-6任一项所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；和/或(Ⅱ)所述轻链可变区的氨基酸序列，如SEQIDNo:7-12任一项所示；者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗VEGFR2单克隆抗体，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。3.根据权利要求1所述的抗VEGFR2单克隆抗体，其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：1)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；2)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；3)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；4)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，轻链可变...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓，金磊，王涛，
申请(专利权)人：长春金赛药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22