一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法技术

本发明专利技术属于细胞模型领域，公开了一种利用慢病毒感染构建稳定表达乙酰胆碱受体簇集(clustered‑AchR)的细胞模型及应用方法，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法包括：慢病毒构建、稳定表达AChR的细胞株的构建与筛选；所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的应用方法包括结合免疫荧光技术、流式细胞技术和Biacore SPR技术检测抗体表达；本发明专利技术通过采用慢病毒感染细胞的方法，通过Rapsyn蛋白使该细胞表面能够稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，从而构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，结合抗原抗体检测免疫荧光技术、流式细胞技术和Biacore SPR技术检测血清乙酰胆碱受体抗体，从而提高抗体阳性检测率。

A Cell Model with Stable Expression of Acetylcholine Receptor Cluster and Its Application

The present invention belongs to the field of cell model, and discloses a cell model and application method for stably expressing acetylcholine receptor cluster (AChR) using lentivirus infection. The method for constructing cell model stably expressing AChR cluster includes: construction of lentivirus, construction and screening of cell strains stably expressing AChR; The application methods of the expressed cell model include combining immunofluorescence technology, flow cytometry technology and Biacore SPR technology to detect antibody expression; The present invention uses the method of lentivirus infection to make the cell surface stably express the acetylcholine receptor protein cluster through Rapsyn protein, thereby constructing the cell model of stable expression of the acetylcholine receptor cluster and binding antigen. \u6297\u4f53\u68c0\u6d4b\u514d\u75ab\u8367\u5149\u6280\u672f\u3001\u6d41\u5f0f\u7ec6\u80de\u6280\u672f\u548cBiacore\u00a0SPR\u6280\u672f\u68c0\u6d4b\u8840\u6e05\u4e59\u9170\u80c6\u78b1\u53d7\u4f53\u6297\u4f53\uff0c\u4ece\u800c\u63d0\u9ad8\u6297\u4f53\u9633\u6027\u68c0\u6d4b\u7387\u3002

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法
本专利技术属于细胞模型
，尤其涉及一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：重症肌无力(Myastheniagravis，MG)是一种由自身抗体所介导的横纹肌神经-肌肉接头处神经递质信号传递障碍的自身免疫性疾病，发病机制与抗乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptorantibody，AchR)抗体密切相关，其发病年龄广、致残率高、易复发、预后差等特点严重威胁人类的健康。到日前为止，国内外有关AchR抗体的检测方法主要有放射免疫沉淀试验、酶联免疫吸附法(ELISA法)及免疫荧光测量法。1)放射免疫沉淀法：灵敏度较高，但有部分患者血清中难以查到抗体，该方法仅利用部分乙酰胆碱受体作为抗原，无法真实模拟细胞表面簇集的乙酰胆碱受体，因而利用该方法检测，许多重症肌无力患者血清乙酰胆碱受体抗体表现为阴性或低滴度。同时，该方法操作相对复杂，也很难同时进行大量样本的检测。2)ELISA法：ELISA技术是目前国内外临床检测AchR抗体的主要方法之一。该法虽具有方便、快捷、无放射性等特点，但该法依然无法再现人体内细胞表面乙酰胆碱受体抗原抗体反应的微环境，因此利用ELISA法检测，仍然存在部分确诊重症肌无力的患者出现乙酰胆碱受体抗体阴性的情况；而且目前商品化试剂盒多，各公司产品敏感度存在差异，很难实行统一标准,不同厂家和型号的试剂盒验出的结果不具有良好的可比性。3)免疫荧光测量法：主要包括荧光素酶免疫系统法和免疫荧光分析法。与放射免疫沉淀法和ELISA等方法相比，其敏感性相对较差，应用价值更为有限。当前，由于上述原因，有20％左右的患者采用上述方法不能检测出血清乙酰胆碱受体抗体。因此，建立敏感度高、实验性血清乙酰胆碱受体抗体检测方法是提高重症肌无力诊断的有效途径，也是目前临床迫切需要解决的问题。综上所述，现有技术存在的问题是：现有抗体检测技术存在敏感度低的重要缺陷，无法有效地再现人体内细胞表面乙酰胆碱受体抗原抗体反应的微环境，因而不能有效检测出重症肌无力患者血清内的乙酰胆碱受体抗体。另外，国内外采用ELISA法检测抗体时固相载体包被的抗原质量有差异，影响检测结果。包被的抗原浓度要求控制于最适稀释浓度，包被浓度过高则结合的抗体洗脱的概率也越高，而浓度过低则不能达到检测要求。上述多种原因造成目前抗体检测阳性率低，对重症肌无力诊断的准确度较低。解决上述技术问题的难度和意义：近年，由于20％的重症肌无力患者血清抗体无法用常规的临床检测方法检出，这些患者的临床诊治严重滞后和受限。虽然已有研究表明基于细胞的抗体检测方法(Cell-basedassays,CBA)可以提高重症肌无力患者血清抗体阳性检出率，但遗憾的是目前现有的重症肌无力的细胞模型无法稳定表达乙酰胆碱受体簇集，每次检测均需重新转染质粒，耗费大量的时间和支出成本，并且无法保证了细胞模型的稳定性和均一性，无法在临床上广泛推广。因此，建立乙酰胆碱受体簇集抗原表达稳定的、敏感度高的、实验性血清乙酰胆碱受体抗体检测方法是提高重症肌无力诊断的有效途径，也是目前临床迫切需要解决的问题，对于提高临床诊断率、发掘可干预的药物治疗靶点具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法，采用构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型来检测血清抗体的技术，该细胞模型高度模仿了神经肌肉接头处紧密簇集的乙酰胆碱受体的三维构象，增加了结合乙酰胆碱受体的亲和度，同时增加了乙酰胆碱受体的密度，预期会显著提高阳性抗体的诊断率。与现有其他每次检测均需转染质粒的细胞模型相比，本专利技术节约了时间和支出成本，同时具有良好的稳定性和均一性，有较高的基础研究与临床推广价值。本专利技术是这样实现的，一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，所述一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型为：乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，具体特征为创新性应用慢病毒感染细胞的方法，通过Rapsyn蛋白使人源胚胎肾细胞(HEK293T)表面稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，从而构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，结合抗原抗体检测BiacoreSPR技术与免疫荧光技术检测血清乙酰胆碱受体抗体，从而提高抗体阳性检测率。本专利技术的另一目的在于提供一种所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法通过采用慢病毒感染细胞的方法，使乙酰胆碱受体α1、β1、δ、ε亚基基因与一种缔合蛋白(Rapsyn)的基因在人源胚肾细胞稳定表达，通过Rapsyn蛋白使该细胞表面能够稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型。进一步，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法包括以下步骤：(1)慢病毒构建；(2)稳定表达AChR细胞株的构建与筛选。进一步，慢病毒构建包括以下步骤：1)过表达AChR质粒制备：人源性AChRα1,β1,Rapsn序列构建于CMV-MCS-PGK-Puro质粒(PHY-008CHRNA1-P2A-CHRNB1-T2A-RAPSN，参见图2)，AChRδ,ε序列构建于CMV-MCS-PGK-Blasiticin质粒(PHY-009CHRND-T2A-CHRNE，见图3)，测序鉴定序列；扩增目的片段，将回收的目的基因进行双酶切，将过表达载体部分与目的片段连接；2)过表达AChR慢病毒包装：使用依赖型成上皮样细胞，将构建好的过表达慢病毒载体及2个辅助包装载体质粒(比例浓度4:1.5:1.5)共转染，加入PEI促进载体进入工具细胞；静置15min后加入到培养的上皮样细胞培养液体系；完成感染后，12h后加入enhancingbuffer，4h后更换新鲜培养液，继续培养48h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液；3)过表达AChR慢病毒浓缩收集：换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugalfilterdevices中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。进一步，稳定细胞系筛选与建立的具体步骤为：1)细胞载体培养与传代：采用人胚胎肾细胞(HEK293T)细胞，生长在DMEM完全培养基中，放在37℃恒温，二氧化碳培养箱中，每2-3天传代一次，每次按照1传4或1传5比例进行。2)细胞载体感染过表达AChR慢病毒：以合适的比例(聚合度约为30％左右，遇到生长较快或慢的细胞，聚合度应适当降低或增加)接种靶细胞于6孔板中。感染前，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含8μg/mLPolybrene的新鲜培养基按合适的MOI值稀释病毒原液，吸除6孔板里旧培养基，加含有慢病毒稀释液到靶细胞中，换液时间可根据细胞状态可适当延长(通常为4-8h)；3)稳定过表达AChR细胞系的筛选：细胞聚合度约为80％-90％时，可传到T25培养瓶中；加入含5μg/mLpuromycin和blasti本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，其特征在于，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型为：利用慢病毒感染构建稳定表达乙酰胆碱受体簇集clustered‑AchR的细胞模型，通过Rapsyn蛋白使人源胚胎肾细胞HEK293T表面稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，结合抗原抗体检测免疫荧光技术、流式细胞技术和Biacore SPR技术检测血清乙酰胆碱受体抗体。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，其特征在于，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型为：利用慢病毒感染构建稳定表达乙酰胆碱受体簇集clustered-AchR的细胞模型，通过Rapsyn蛋白使人源胚胎肾细胞HEK293T表面稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，结合抗原抗体检测免疫荧光技术、流式细胞技术和BiacoreSPR技术检测血清乙酰胆碱受体抗体。2.一种如权利要求1所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法，其特征在于，采用慢病毒感染细胞的方法，使乙酰胆碱受体α1、β1、δ、ε亚基的基因与一种缔合蛋白Rapsyn的基因在人源胚肾细胞稳定表达，通过Rapsyn蛋白使该细胞表面能够稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型。3.如权利要求2所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法包括以下步骤：(1)慢病毒构建；(2)稳定表达AChR细胞株的构建与筛选。4.如权利要求3所述的乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法，其特征在于，慢病毒构建包括以下步骤：1)过表达AChR质粒制备：人源性AChRα1,β1,Rapsn序列构建于CMV-MCS-PGK-Puro质粒(PHY-008CHRNA1-P2A-CHRNB1-T2A-RAPSN，参见图2)，AChRδ,ε序列构建于CMV-MCS-PGK-Blasiticin质粒，测序鉴定序列；扩增目的片段，将回收的目的基因进行双酶切，将过表达载体部分与目的片段连接；2)过表达AChR慢病毒包装：使用依赖型成上皮样细胞，将构建好的过表达慢病毒载体及2个辅助包装载体质粒比例浓度4:1.5:1.5共转染，加入PEI促进载体进入工具细胞；静置15min后加入到培养的上皮样细胞培养液体系；完成感染后，12h后加入enhancingbuffer，4h后更换新鲜培养液，继续培养48h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液；3)过表达AChR慢病毒浓缩收集：换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugalfilterdevices中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。5.如权利要求3所述的乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法，其特征在于，稳定细胞系筛选与建立的具体步骤为：1)细胞载体培养与传代：采用人胚胎肾细胞HEK293T细胞，生长在DMEM完全培养基中，放在37℃恒温，二氧化碳培养箱中，每2-3天传代一次，每次按照1传4或1传5比例进行；2)细胞载体感染过表达AChR慢病毒：接种靶细胞于6孔板中；感染前，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含8μg/mLPolybrene的新鲜培养基按合适的MOI值稀释病毒原液，吸除6孔板里旧培养基，加含...

【专利技术属性】
技术研发人员：管阳太，蔡昱，韩露，朱德生，杨红，王永刚，李建萍，张瑛，刘明媛，郝勇，谢冲，王亦舒，
申请(专利权)人：管阳太，
类型：发明
国别省市：上海,31