运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法技术方案

本发明专利技术涉及大麦转基因材料的构建，旨在提供一种运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法。该方法包括下述步骤：gRNA靶位点的选择、gRNA片段的克隆、GG(gRNA‑gRNA)片段的连接、连接产物的PCR扩增、纯化产物和目标载体的酶切、纯化产物和目标载体的连接反应、连接产物转化大肠杆菌感受态、农杆菌介导的大麦转基因、阳性转基因植株的筛选、突变体测序。本发明专利技术利用先进的基因编辑技术‑CRISPR‑Cas9系统对大麦VE合成通路中的关键基因(HPT)进行靶向基因编辑，获得有效的功能缺失突变体，为大麦中生物活性物质的研究创造条件。

The use of CRISPR Cas9 system knock out key gene HPT in the synthetic pathway of barley VE

The present invention relates to transgenic barley construction materials, aiming to provide a knock out HPT key gene synthesis pathway in VE barley using CRISPR Cas9 system. The method comprises the following steps: gRNA target site selection and cloning of gRNA fragment, GG (gRNA gRNA) fragment link product of PCR amplification, purification and enzyme digestion and purification of the target vector and the target vector product of ligation reactions, the products were transformed Escherichia coli and Agrobacterium mediated transgenic barley, transgenic plants of the mutant screening and sequencing. The invention uses the advanced technology of CRISPR Cas9 gene editing system on the key gene synthesis pathway of barley in VE (HPT) for targeted gene editing, gain of function mutant effectively, create conditions for the research of bioactive substances in barley.

【技术实现步骤摘要】
运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
本专利技术涉及大麦转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR-Cas9系统敲除HvHPT(MLOC_37476)基因的应用。
技术介绍
维生素E(vitaminE，VE)是由光合生物合成的生育酚类化合物的总称。根据侧链是否饱和，VE可以分为生育酚(tocophero1)和生育三烯酚(tocotrieno1)两大类。根据芳香环上甲基位置和数目的不同，每类又可分为α，β，γ，δ四种形式，其中，α-生育酚活性最高。近些年来，由于生育三烯酚在某些方面更优越的生物学特性，备受人们关注。不仅表现在抗氧化活性，在降胆固醇、预防糖尿病、促进骨吸收、抗癌、神经保护等方面也有一定的作用。大麦是世界上四大粮食作物之一，主要用于食品生产、动物饲养、啤酒制造等领域。另外，由于大麦含有丰富的生物活性物质如β-葡聚糖、酚类物质、维生素E等，也常被用作功能食品开发的原料。大麦谷粒，含有丰富的生育三烯酚，大概占VE总含量的70％，是研究生育三烯酚的好材料。因此利用基因工程手段调控大麦谷粒中的VE合成通路，可以提高大麦生育三烯酚的含量，从而起到增加大麦谷粒营养成分的作用。目前由于大麦突变体库的缺乏，限制了大麦VE合成通路中相关基因的功能研究。近年来发展起来的以CRISPR-Cas9为代表的新一代基因组编辑技术，为植物基因工程带来了新的革命，已成为基因功能研究和作物品质改良的重要手段之一。运用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术改造相关基因，并通过自交、分子鉴定和后代筛选，获得“非转基因”大麦新材料，可为今后将成果应用于生产实践提供依据和技术支持。但是因为大麦基因转化效率低，稳定转基因材料的获得周期长，目前运用CRISPR-Cas9系统研究大麦基因的报导很少见。因此，应用CRISPR-Cas9技术敲除大麦VE合成通路中的关键基因(HvHPT)而获得的大麦突变体，可为HvHPT基因的功能研究提供可靠材料。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，以获得HPT基因突变的理想突变体。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，包括以下步骤：(1)gRNA靶位点的选择由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则，应尽量将gRNA靶位点设计在外显子区并且要设计在基因的5’端(因该基因编码的是蛋白质，5’端编码的正好是蛋白质的功能区域)。(2)gRNA片段的克隆以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个片段L1、L2、L3、L4部分重叠的片段，引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：L1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGGL1-R：CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGGL2-F：TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAAL2-R：CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGGL3-F：TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAAL3-R：CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGGL4-F：TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAAL4-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGPCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×PhusionHFBuffer10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs4μL；pGTRplasmid0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系。PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR反应后，取5-10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；(3)GG(gRNA-gRNA)片段的连接根据测定的PCR产物浓度，将四个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行；取L1、L2、L3、L4各2μL，与10μLT7ligasebuffer、1μLBsaI-HF、0.5μLT7ligase、0.5μL水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃，5min；20℃，10min；30-50个循环；(4)连接产物的PCR扩增；连接反应结束后，取连接产物1μL，加19μL水稀释，将稀释后的产物作为模板，进行PCR扩增；PCR结束后，取5μL产物进行电泳检测，并将产物纯化；产物大小为500bp；引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：S1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAS1-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC(5)纯化产物和目标载体的酶切FokI酶切纯化产物暴露黏性末端，同时BsaI酶切空载体pRGEB32；酶切体系为50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32；酶切时间3-4h，酶切温度37℃；用2％琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物，测定浓度；(6)纯化产物和目标载体的连接反应取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng)，T4DNAligase1μL，10×T4DNAligaseBuffer1μL，加三蒸水至20μL，4℃连接过夜；(7)连接产物转化大肠杆菌感受态将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，37℃过夜；挑取单菌落，摇菌6-8h，提取质粒，PCR鉴定目标片段是否连入载体；鉴定正确的质粒送去测序，将测序结果正确的质粒，电转化农杆菌AGL1；(8)农杆菌介导的大麦转基因以GoldenPromise野生型大麦的幼胚为外植体材料，以AGL1农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株；(9)阳性转基因植株的筛选提取转基因植株的基因组DNA，在三个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；(10)突变体测序将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体测序，确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。专利技术原理描述：VE的合成通路比较复杂，生育酚和生育三烯酚有共同的合成前体尿黑酸(homogentisate，HGA)。其中生育三烯酚合成的限速步骤是由尿黑酸牻牛儿基转移酶(homogentisategeranylgeranyltransferase，HGGT)催化HGA和牻牛儿焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGDP)的合成反应；而生育酚合成的限速步骤是由尿黑酸植基转移酶(homogentisatephytyltransferase，HPT)催化HGA和植基二磷酸(phytyldiphosphate本文档来自技高网...

【技术保护点】
运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gRNA靶位点的选择由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR‑Cas9技术的靶位点设计原则，选择gRNA靶位点在基因5’端的外显子区；(2)gRNA片段的克隆以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个部分重叠的片段L1、L2、L3、L4；其中，PCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×Phusion HF Buffer 10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs 4μL；pGTR plasmid 0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系；上下游引物的序列如SEQ ID NO：1～8所示：PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR反应后，取5～10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；(3)gRNA‑gRNA片段的连接根据测定的PCR产物浓度，将L1、L2、L3、L4四个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行；取L1、L2、L3、L4各2μL，与10μL T7ligase buffer、1μLBsaI‑HF、0.5μL T7ligase、0.5μL水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃，5min；20℃，10min；30‑50个循环；(4)连接产物的PCR扩增；连接反应结束后，取连接产物1μL，加19μL水稀释，将稀释后的产物作为模板，进行PCR扩增；PCR结束后，取5μL产物进行电泳检测，并将产物纯化；产物大小为500bp；PCR所用引物的序列如SEQ ID NO：9～10所示；(5)纯化产物和目标载体的酶切FokI酶切纯化产物暴露黏性末端，同时BsaI酶切空载体pRGEB32；酶切体系为50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32；酶切时间3‑4h，酶切温度37℃；用2％琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物，测定浓度；(6)纯化产物和目标载体的连接反应取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng)，T4DNA ligase 1μL，10×T4DNA ligase Buffer 1μL，加三蒸水至20μL，4℃连接过夜；(7)连接产物转化大肠杆菌感受态将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，37℃过夜；挑取单菌落，摇菌6‑8h，提取质粒，PCR鉴定目标片段是否连入载体；鉴定正确的质粒送去测序，将测序结果正确的质粒，电转化农杆菌AGL1；(8)农杆菌介导的大麦转基因以Golden Promise野生型大麦的幼胚为外植体材料，以AGL1农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株；(9)阳性转基因植株的筛选提取转基因植株的基因组DNA，在三个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；(10)突变体测序将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体测序，确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。...

【技术特征摘要】
1.运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gRNA靶位点的选择由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则，选择gRNA靶位点在基因5’端的外显子区；(2)gRNA片段的克隆以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆四个部分重叠的片段L1、L2、L3、L4；其中，PCR体系为：Phusion酶0.5μL；5×PhusionHFBuffer10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs4μL；pGTRplasmid0.5μL；三蒸水30μL，共50μL体系；上下游引物的序列如SEQIDNO：1～8所示：PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR反应后，取5～10μL产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收目的片段，测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度；(3)gRNA-gRNA片段的连接根据测定的PCR产物浓度，将L1、L2、L3、L4四个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行；取L1、L2、L3、L4各2μL，与10μLT7ligasebuffer、1μLBsaI-HF、0.5μLT7ligase、0.5μL水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃，5min；20℃，10min；30-50个循环；(4)连接产物的PCR扩增；连接反应结束后，取连接产物1μL，加19μL水稀释，将稀释后的产物作为模板，进行PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：边红武，曾章慧，刘翠翠，韩凝，朱睦元，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33