本发明专利技术涉及一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型及其制备方法和应用。本发明专利技术优点在于：模型设计符合最小量化的手术及动物制模原则，仅仅刮除了特定区域的角膜内皮细胞层，而保留了角膜后弹力层，同时未对角膜其它结构造成任何的损伤；通过一组设计不同形状和区域的角膜内皮细胞层损伤的动物模型建立，能直接了解各个区域细胞的增生情况，还可用于治疗性药物的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及眼科医学模型领域，具体地说，是一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型。
技术介绍
角膜的解剖结构分为5层，由外向内依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。内皮位于角膜结构的最内层，由单层角膜内皮细胞组成，通过屏障功能和离子泵功能维持角膜的透明性，其中，人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCECs)的形态完整和功能健全至关重要。角膜内皮失代偿将导致角膜混浊、严重影响视力，临床中最常见的病因是Fuchs角膜内皮营养不良、大泡性角膜病变、人工晶体植入或其他内眼手术后内皮损伤过多等，现已成为致盲病因中的一项重要因素。角膜内皮细胞损伤通过细胞移行和有丝分裂愈合，细胞移行是人类和各种动物共有的愈合方式，但角膜内皮细胞有丝分裂活动随动物种类和年龄而异，兔、鼠和牛的角膜内皮细胞具有较强的增殖能力，人的角膜内皮细胞则增殖能力较弱。HCECs来源于胚胎期神经嵴细胞，角膜内皮层从出生后开始发育，HCECs会在角膜内皮单层发育成熟后停止增殖，且内皮细胞在正常条件下将终生保持无复制状态，所以，婴幼儿和成人体内HCECs分裂增殖速率远不能满足死亡或受损细胞的替换，导致HCECs密度随着年龄增长和损伤而降低。故传统认为人角膜内皮损伤后不能再生，创面主要通过细胞移行和扩大而愈合。目前取代病变和受损的角膜内皮、恢复角膜透明性的方法多为角膜移植术，特别是角膜内皮移植术。尽管穿透性角膜移植术和角膜内皮移植术能够重新恢复角膜的透明性，但对供体角膜内皮质量和细胞数量要求较高，同时也存在术后免疫排斥、内皮失功、继发青光眼等问题。由于供体角膜尤其是适合内皮移植的角膜严重缺乏，寻找角膜内皮细胞再生的方法是目前研究的焦点。近年来，ROCK信号通路抑制剂促进角膜内皮再生的研究取得了很大进展。ROCK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，其活性表现为磷酸化其下游的信号分子，发挥调节细胞骨架结构、应力纤维形成及细胞收缩的功能。Y-27632是选择性的ROCK抑制剂，多项研究表明其具有促进角膜内皮细胞损伤后修复的作用。将体外培养获得的角膜内皮细胞注入缺失内皮细胞的兔眼前房中，与此同时在治疗组中注入一定量的Y-27632，结果发现治疗组中移植的内皮细胞与受体兔的角膜后弹力层紧密黏附，内皮细胞形态及功能正常，角膜恢复透明，而未加入Y-27632的对照组角膜仍然水肿，并且移植的内皮细胞大多数转化为成纤维细胞；在猴的模型重复这一实验也得到了类似的结果。由此可见ROCK抑制剂有望成为角膜内皮病变的新的治疗手段。为了进一步的实验研究，角膜内皮损伤动物模型不可或缺。且有研究表明，角膜内皮细胞的再生能力，在体和离体、中央区域和周边区域等是有所差别的，这就需要有相应的不同区域角膜内皮损伤的动物模型来辅助研究。目前国内外尚无相关角膜内皮损伤动物模型的专利，但在许多论文中都涉及到了相关动物模型的应用。比如在2014年11月的《Cornea》杂志上名为New Therapeutic Modality for Corneal Endothelial Disease Using Rho-Associated Kinase Inhibitor Eye Drops的文章，2013年4月发表在《Investigative ophthalmology&visual science》上名为The ROCK inhibitor eye drop accelerates corneal endothelium wound healing的文章，均采用经角膜上皮冷冻冻伤全层角膜的方法来破坏角膜内皮细胞；又如在2012年《Experimental Eye Research》上名为Development of new therapeutic modalities for corneal endothelial disease focused on the proliferation of corneal endothelial cells using animal models的文章，涉及到了用规格为20-gauge的针头对角膜内皮进行刮擦的方法来破坏角膜内皮细胞的方法。但是这些方法都存在着过度伤害(如损伤了全层角膜、或针尖刮破了角膜后弹力层等)和损伤范围及程度不确定等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型。本专利技术的第二个目的是，提供一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型的制备方法。本专利技术的第三个目的是，提供一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型，所述的动物模型由动物准备、动物手术和手术后处理步骤制备得到：在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的兔科动物，术前抗生素眼液点眼3次/天，共3天；在动物手术步骤中，将动物全身麻醉后，消毒铺巾，开睑器开睑，15°穿刺刀制作角膜穿刺口，前房内注入无菌空气10分钟，采用角膜内皮刮铲，对角膜动物术眼角膜内皮进行反复刮擦，只损伤特定区域的角膜内皮层，完整保留与其贴附的后弹力层；在手术后处理步骤中，给手术动物双眼抗菌药物滴眼，每天3-5次。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型的制备方法，由动物准备、动物手术和手术后处理步骤组成；在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的兔科动物，术前抗生素眼液点眼3次/天，共3天；在动物手术步骤中，将动物全身麻醉后，消毒铺巾，开睑器开睑，15°穿刺刀制作角膜穿刺口，前房内注入无菌空气10分钟，采用角膜内皮刮铲，对角膜动物术眼角膜内皮进行反复刮擦，只损伤特定区域的角膜内皮层，完整保留与其贴附的后弹力层；在手术后处理步骤中，给手术动物双眼抗菌药物滴眼，每天3-5次。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的动物模型在研究不同区域角膜内皮细胞的再生情况中的应用。所述的动物模型在治疗性药物的筛选中的应用。本专利技术优点在于：1、本专利技术的模型设计符合最小量化的手术及动物制模原则，仅仅刮除了特定区域的角膜内皮细胞层，而保留了角膜后弹力层，该模型同时未对角膜其它结构造成任何的损伤；2、通过一组设计不同形状和区域的角膜内皮细胞层损伤的动物模型建立，能直接了解各个区域细胞的增生情况，还可用于治疗性药物的筛选。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型，其特征在于，所述的动物模型由动物准备、动物手术和手术后处理步骤制备得到：在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的兔科动物，术前抗生素眼液点眼3次/天，共3天；在动物手术步骤中，将动物全身麻醉后，消毒铺巾，开睑器开睑，15°穿刺刀制作角膜穿刺口，前房内注入无菌空气10分钟，采用角膜内皮刮铲，对角膜动物术眼角膜内皮进行反复刮擦，只损伤特定区域的角膜内皮层，完整保留与其贴附的后弹力层；在手术后处理步骤中，给手术动物双眼抗菌药物滴眼，每天3‑5次。
【技术特征摘要】
1.一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型，其特征在于，所述的
动物模型由动物准备、动物手术和手术后处理步骤制备得到：在动物准备步骤
中，选用无眼部疾患的兔科动物，术前抗生素眼液点眼3次/天，共3天；在
动物手术步骤中，将动物全身麻醉后，消毒铺巾，开睑器开睑，15°穿刺刀制
作角膜穿刺口，前房内注入无菌空气10分钟，采用角膜内皮刮铲，对角膜动
物术眼角膜内皮进行反复刮擦，只损伤特定区域的角膜内皮层，完整保留与其
贴附的后弹力层；在手术后处理步骤中，给手术动物双眼抗菌药物滴眼，每天
3-5次。
2.一种用于研究角膜内皮细胞损伤修复的动物模型的制备方法，其特征在
【专利技术属性】
技术研发人员：毕燕龙，王怡然，周祁，沈俊慧，刘歆，陈冉冉，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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