一种脱细胞角膜的制备方法技术

一种脱细胞角膜的制备方法，本发明专利技术采用脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤。所制备的脱细胞角膜抗原去除彻底，不会激起宿主获得性免疫反应，生物相容性好，对天然角膜基质的损伤小，保留了天然角膜的结构特性，也保留了天然角膜的有效成分，因此有着与天然角膜相似的物理化学特性；所制备的脱细胞角膜移植后，经动物实验显示，移植角膜透明、无瘢痕形成，不发生融解、无新生血管；移植后1个月即与植床完全融合，3个月角膜已经完全上皮化，并有角膜基质细胞向脱细胞角膜植片迁移，证明组织正在发生缓慢的改建，6个月后移植的角膜与天然角膜在组织学和外观检测中无明显差异。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织工程学生物医用材料
，具体涉及。
技术介绍
角膜是维持人体正常视力最重要的组织之一。角膜会由于发生圆锥角膜、大泡性角膜、真菌感染、外伤瘢痕等疾病造成视力下降或失明，现今角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病。目前治疗角膜盲最为有效的方式是异体角膜移植，然而异体角膜来源的缺乏造成大量患者得不到及时治疗而最终失明。据统计全球有超过1000万的人口遭受角膜盲疾病，然而仅有不到12万的患者能够接受异体角膜的移植治疗。为解决临床角膜供体不足的问题，人们试图用高分子合成材料或天然衍生材料构建人工角膜。高分子合成材料通常包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，由于这类材料生物相容性差，不能实现与宿主植床的融合，不是理想的人工角膜材料。如最具代表性的波士顿人工角膜，该角膜只能应用于异体角膜移植反复失败、高危植床等有限的适应症上，由于该角膜产品属于一种特殊屈光装置，不具生物活性，在移植后的外观和受体的舒适感与自然角膜差异很大。理想的人工角膜应有好的生物相容性、透明度、低免疫原性。天然衍生材料由于具有良好的生物相容性，被广泛用于人工角膜的制备，如胶原、胶原与糖胺聚糖混合体、胶原与壳聚糖混合体等。天然衍生材料制备的人工角膜最具代表性的是AlphaCor?，该角膜是由经过交联的胶原制备而成，与人天然角膜有类似的外形和机械性能，该角膜产品已应用于临床。经长期观察发现，AlphaCor?在移植后会出现缓慢的角膜基质降解，并出现难以上皮化的现象，主要原因是其无法模拟天然角膜的超微结构。天然角膜从外至内是由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成，其中基质层是由有序的胶原束与蛋白聚糖排列组成的透明组织，胶原束直径为22~32nm，间距约30nm，该空间距离是由胶原与蛋白聚糖分子中的氢键所维持，这种结构能阻止散光发生，并为角膜提供特殊生物力学性能以抵御眼内压力。迄今为止，还无法利用生物材料在体外模拟角膜如此精密复杂的结构。随着脱细胞技术的快速发展，通过对天然组织的处理，去除天然组织中的细胞及其他抗原成分，并保留天然组织中细胞外基质成分以及空间结构。脱细胞技术已广泛应用于血管、皮肤、心脏瓣膜、神经等组织，脱细胞的天然组织也被用于组织损伤修复。目前已有脱细胞天然组织广泛应用于临床，并取得了良好的组织修复效果。天然猪角膜与人角膜有着高度相似的组织生理结构，因此猪角膜已被研究作为原料制备脱细胞角膜，并作为异体角膜替代物用于角膜板层移植。最初脱细胞的方式是采用TritonXlOO联合胰酶进行处理，该方法虽然能够完全去除组织中的细胞，但对天然角膜的胶原微结构和糖胺聚糖成分破坏严重，致使处理后的角膜丧失了天然角膜大部分的组织特性，移植后与组织融合效果较差，无法达到治疗目的。为了避免角膜基质结构的严重破坏，又有仅采用去污剂(例如 TritonXlOO、十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠等)进行脱细胞处理，但十二烷基磺酸钠等离子型去垢剂仍对组织有很大程度破坏，且去垢剂的残留难以洗脱，容易造成脱细胞角膜的细胞毒性。此外有采用特异性破坏细胞膜的磷脂酶代替广谱性酶进行脱细胞处理，仍难以达到完全去除细胞抗原的目的，移植后会诱发较强的免疫宿主反应；因此采用与去垢剂(例如脱氧胆酸钠)联合使用，仍无法避免对天然角膜基质的影响，且磷脂酶非常昂贵，难以实现脱细胞角膜的产品化。日本学者采用低温高压法对猪角膜进行处理，达到了脱细胞效果，但是高压法对设备要求非常严苛，且高压条件下角膜的胶原也会产生变性，影响脱细胞角膜的治疗效果。为避免化学去垢剂与生物酶对脱细胞角膜微结构的损害，有学者采用交联方法加强角膜结构，传统的交联剂(如戊二醛、EDC等)会使角膜基质整体结构全部交联，导致角膜基质失去天然角膜的弹性和韧性，更严重的是导致角膜基质的生物相容性下降，移植后不与植床融合，最终被宿主排斥。因此要保留天然角膜的透明性与机械性能达到更好的角膜修复效果，需要摆脱现有的角膜脱细胞技术，建立全新的角膜脱细胞工艺。
技术实现思路
针对现有技术的存在问题，本专利技术的目的是提供，所制备的脱细胞角膜具有天然角膜的基质层和前弹力层，保留了天然角膜的物理化学性能，生物相容性好、透明度好，可替代异体角膜进行板层角膜修复。本专利技术提出的脱细胞角膜制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护与灭菌的步骤，具体如下: 步骤一、脱角膜上皮层:将哺乳动物角膜置入0.05~0.2M的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，浸泡12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2~1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层；所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1~0.5 cm宽的巩膜； 所处理的角膜需保留一定宽度的巩膜，为后续步骤中多次采用振荡处理，需借助巩膜保护角膜结构，防止角膜基质断裂。组织学结果显示含巩膜的角膜在脱细胞处理后角膜基质排列有序，而不含巩膜的则基质结构散乱。角膜上皮层与角膜基质结合紧密，金属离子在角膜上皮层与基质层的连接中发挥重要作用，本步骤采用EDTA金属螯合剂处理角膜，减弱角膜上皮层与基质层的贴附强度，结合角膜溶胀，使角膜上皮层能轻易去除。步骤二、紫外交联:采用370nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面20~60分钟，完成交联处理； 角膜前弹力层在角膜损伤后的上皮再生中发挥着关键作用，为了避免振荡洗涤等处理对角膜前弹力层的结构造成损坏，影响角膜上皮化，并平衡脱细胞工艺强度，所以采用紫外交联的方法强化角膜前弹力层的稳定性。步骤三、病毒灭活:用刀具在角膜的后弹力层面划2~10根划痕，划痕深度< Imm;将角膜放入浓度为5~80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5~3h,转入海藻糖浓度为5~80mg/ml、乙醇浓度为70ml/100ml的混合溶液中浸泡2h,再转入浓度为2~10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留；角膜后弹力层与前弹力层结构致密，要彻底去除细胞需要长时间接触脱细胞处理液，但同时会对角膜基质造成损伤。由于最终制备的脱细胞角膜不含角膜后弹力层，因此本步骤利用后弹力层保护角膜基质不受到机械损伤，对后弹力层进行划痕破损，使脱细胞处理液更容易渗入角膜基质。70ml/100ml的乙醇溶液能够去除动物角膜中的病毒成分，但会使角膜脱水，导致蛋白间的氢键相互连接、发生变性，影响脱细胞角膜与受体植床的融合性；而海藻糖富含醛基，能够替代水分子与蛋白质形成氢键，从而避免蛋白质由于脱水而发生变性。因此采用海藻糖对角膜基质蛋白进行保护。步骤四、脱细胞处理:将步骤三得到的角膜置入I~5M的NaCl溶液中振荡处理0.25~4h,再转入去离子水中振荡清洗0.25~4h ;然后转入20~60mM的NaOH溶液中振荡处理0.25~4h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH达到4~8; 所采用高、低渗溶液处理角膜，使角膜基质细胞在强烈的脱水、溶胀过程中破裂，再利用NaOH溶液除去破碎细胞的残留成分。步骤五、梯度脱水:将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05~0.2M的MgCl2水溶液中浸泡10~60分钟；采用在50ml/100ml~90ml/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞角膜的制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤，具体如下：步骤一、脱角膜上皮层：将哺乳动物角膜置入0.05～0.2M的乙二胺四乙酸溶液中浸泡12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2～1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层; 所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1～0.5 cm宽的巩膜；步骤二、紫外交联：采用370 nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面20～60分钟，完成交联处理; 步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层面划2～10根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入浓度为5～80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5～3h，转入含有5～80mg/ml浓度海藻糖和含70ml/100ml浓度乙醇的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2～10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入1～5M的NaCl溶液中振荡处理0.25～4h，再转入去离子水中振荡清洗0.25～4h；然后转入20～60mM的NaOH溶液中振荡处理0.25～4h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH达到4～8;步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05～0.2M的MgCl2水溶液中浸泡10～60分钟; 采用在50ml/100ml～90ml/100ml范围内浓度梯度的甘油，从低浓度到高浓度对角膜进行2～3次的脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜厚度; 步骤六、辐照保护和灭菌：将步骤五得到的角膜放入5～30 mg/ml浓度的甘露醇溶液中5～15分钟; 按照需要厚度，采用物理方法对角膜进行削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用15～25 kGy的钴60辐照灭菌。...

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞角膜的制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤，具体如下: 步骤一、脱角膜上皮层:将哺乳动物角膜置入0.05~0.2M的乙二胺四乙酸溶液中浸泡.12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2~1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层；所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1~0.5 cm宽的巩膜； 步骤二、紫外交联:采用370 nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面.20~60分钟，完成交联处理； 步骤三、病毒灭活:用刀具在角膜的后弹力层面划2~10根划痕，划痕深度< Imm;将角膜放入浓度为5~80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5~3h,转入含有5~80mg/ml浓度海藻糖和含70ml/100ml浓度乙醇的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2~10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗海浪，
申请(专利权)人：陕西佰傲再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61