鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞（cornealendothelialcells,CECs）新的分子标记物的方法，确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因，鉴定了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。本发明专利技术提供的一种鉴定胎儿和成人角膜内皮细胞的方法，通过该方法确认了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。角膜内皮细胞（CECs）发育过程中阶段特异性标记物的确定将对定义由干细胞分化而来的CECs以及细胞替代治疗角膜内皮相关疾病具有重要意义，弥补了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物不足的缺憾。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域，更具体地，涉及鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记方法。
技术介绍
角膜内皮细胞(corneal endothelial cells, CECs)位于角膜最内层，为一单层六角形立方上皮，胞质内细胞器含量丰富，细胞间连接紧密，主要为缝隙连接，具有良好的屏障作用。角膜内皮细胞膜上存在Na+-K+-ATP酶，该酶参与钠、钾离子的交换过程，主动将 Na+转至细胞外，并将K+泵入细胞内，从而维持细胞膜内外的离子浓度梯度。角膜内皮细胞 Na+-K+-ATP酶在进行离子转运的同时，也将水分子从基膜侧(基质)转运到顶膜侧(房水)，以抵消基质通过角膜上皮和内皮时被动性水吸收带来的肿胀趋势，从而维持角膜基质的相对脱水状态和角膜的透明性。成人角膜内皮细胞失去有丝分裂能力，细胞停留在Gl期。由遗传性疾病、创伤和老化等导致的角膜内皮细胞缺陷将导致角膜不可逆水肿、失去透明性并最终导致失明。角膜内皮细胞的遗传性紊乱，包括富克斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial coneal dystrophy, FECD)、后部多形性角膜营养不良(posterior polymorphous coneal dystrophy, PPCD) >先天遗传性内皮营养不良I型和2型(congenital hereditary endothelial dystrophy type I and 2, CHEDl and CHED2)、X 连锁性角膜内皮营养不良 (X-linked endothelial corneal dystrophy, XECD)等。近年来，有关这些遗传性角膜营养不良症的遗传学机制有了陆续的研究和报道。比如，有研究指出，后弹力层(由角膜内层上皮细胞分泌而来)的主要组成成分一VIII A2型胶原蛋白(C0L8A2)—的变异，与早期FE⑶ 及PP⑶相关；而溶质携带物家族All (SLC4A11)的变异与迟发性FE⑶及PP⑶2相关。鉴于目前的研究现状，更多的靶基因有待发现。临床上，除了移植整个角膜，内角膜移植术和后弹力层角膜内皮移植术等眼科手术也可以用于替代功能性失调CECs，但均存在供体细胞来源缺乏和免疫排斥等问题。干细胞的发展为获得功能性的CECs提供了全新的思路，有研究者从神经嵴细胞分化得到CECs， 以及有用人类成体干细胞，比如角膜内皮基质干细胞、间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞分化得到CECs的报道。理论上讲，通过体外多能干细胞(人·类胚胎干细胞或诱导多能干细胞)分化，可以获得无限量的CECs用于细胞替代治疗。目前，研究者多以蛋白标记物用于鉴定成人CECs，这些蛋白多与细胞黏附、缝隙连接以及泵功能相关，比如N-1丐黏着蛋白(N-cadherin)、间隙连接蛋白43 (connesin_43)、 ZO-U Na+-K+-ATP 酶(Na+-K+-ATPase)和密封蛋白(Occludin)等。但是，与 CECs 成熟过程相关的分子通路和胎儿/成体CECs特异的分子标记物的研究少之又少。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物的不足，提供一种基于RNA-Seq技术及生物信息学分析用于。本专利技术的技术方案为:一种，包括以下几步:(1)胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达A:从Illumina系统的RNA-Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97 个样本；B:确定了 245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因;(2)胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达C:比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；D:通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到SlOO蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述SlOO蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4，S100A5和S100A6 ；(3)在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因E:检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是fct5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达， 说明在 蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即fct5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；F:通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；G:检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示， IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细胞核中，IER3为判定角膜内皮细胞发育程度的蛋白标记物。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述的245个在胎儿期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与胞外基质结构组成、血小板来源生长因子结合和生长因子活性。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述的284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与调节无机阴离子的跨膜转运活性、转录因子活性和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子的活性。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤C中得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因，是基因表达倍数界限提至5倍变化数，以此为分析标准而得到的。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，参与代谢过程的基因在所述成人角膜内皮细胞中高表达的518个基因中是上调的。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述胎儿角膜内皮细胞中高表达的668个基因参与金属肽酶活性、胞外结构和TGF-beta信号。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤(2)胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达在角膜内皮细胞发育成熟的过程中在选定的信号通路上存在转录变化。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述SlOO蛋白家族的mRNA仅在成人角膜内皮细胞高表达。本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，在TGF-beta和Wnt信号通路中表达特异基的标记物因包括以下一种或几种:S100A4、S100A5、S100A6和Wnt5a。本专利技术的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果:本专利技术提供的一种鉴定胎儿和成人角膜内皮细胞的方法，通过该方法确认了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。角膜内皮细胞(CECs)发育过程中阶段特异性标记物的确定将对定义由干细胞分化而来的CECs以及细胞替代治疗角膜内皮相关疾病具有重要意义，弥补了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物不足的缺憾。【附图说明】图1:成体和胎儿CECs新的特异标记物Wnt5a的免疫荧光检测。图2:成体和胎儿CECs新的特异标记物S100A4的免疫荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，包括以下几步：（1）胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达A：从Illumina系统的RNA?Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97个样本；B：确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因；（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达C：比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；D：通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述S100蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4,?S100A5和S100A6；（3）在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因E：检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是Wnt5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达，说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即Wnt5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；F：通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；G：检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示，IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细胞核中，IER3为判定角膜内皮细胞发育程度的蛋白标记物。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，包括以下几步:(1)胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达A:从Illumina系统的RNA-Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97 个样本；B:确定了 245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因;(2)胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达C:比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；D:通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述SlOO蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4，S100A5和S100A6 ；(3)在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因E:检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是Wnt5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达， 说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即Wnt5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；F:通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；G:检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示， IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛志刚，林卿，曾维鸣，
申请(专利权)人：苏州瑞奇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：