本发明专利技术涉及一种检测花生过敏原用扩增内标、其构建方法及其应用。该扩增内标基因的序列为SEQIDNO.1所示的碱基序列。这预示了在DNA水平检测已深加工食品中所含的过敏原物质是可能的。采用本发明专利技术的扩增内标进行花生过敏原的PCR检测具有较高的灵敏度和特异性，可用于实际商品检测，并能有效排除可能存在的假阴性结果，具有一定的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
检测花生过敏原用扩增内标、其构建方法及其应用
本专利技术涉及一种检测花生过敏原用扩增内标、其构建方法及其应用。
技术介绍
由于食品成分及其加工的复杂性，在DNA提取中残留的某些杂质成分对PCR扩增可能产生抑制作用，除抑制剂以外，其他原因主要有PCR仪故障、PCR检测体系不恰当、DNA聚合酶失活以及人为操作失误等，可能导致PCR检测出现假阴性结果，这会使得花生过敏患者误食含有花生成分的食品，造成食品安全问题，危害公众健康，因而需要绝对避免。在PCR反应体系中加入扩增内标(internal amplification control, IAC)是指示假阴性结果的有效手段之一，近年来已经成为PCR检测标准化的趋势。扩增内标(InternalAmplification Control, IAC)是添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建的DNA序列。其作用原理是:将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的序列的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。从扩增内标与目的序列在扩增时是否存在竞争性的角度，扩增内标可分为两类:竞争性扩增内标与非竞争性扩增内标。竞争性扩增内标是指在同一 PCR反应体系中与目的基因序列共用同一对引物进行扩增反应的一段基因序列。非竞争性扩增内标则是指在PCR扩增反应中不与目的基因序列共用同一对引物的一段序列。用竞争性扩增内标可以避免在同一 PCR检测体系中使用多对引物，进而可`以避免引物间的相互作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种检测花生过敏原用扩增内标。本专利技术的目的之二在于提供该扩增内标的构建方法。本专利技术的目的之三在于提供使用该扩增内标在检测花生过敏原中的应用。假阴性是指由于PCR反应体系中存在抑制因素及其他相关原因致使原来应该为阳性的结果却呈现阴性的现象。扩增内标(Internal Amplification Control, IAC)是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建的DNA序列。在PCR反应体系中加入扩增内标是指示假阴性结果的有效手段之一，因为将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的序列的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。实验结果表明，通过复合引物技术构建扩增内标，以及确定扩增内标在PCR体系中的添加量，可以检测食品中的花生成分。本专利技术在上述基础上完成。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种检测花生过敏原用扩增内标，其特征在于该扩增内标基因的序列为SEQ ID N0.1所不的喊基序列。一种构建上述的检测花生过敏原用扩增内标的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.通过BLAST比对，选择与花生过敏原Arah I基因同源性较低的单增李斯特菌FSLR2-561基因(NC_017546 )作为内参基因，根据内参基因的序列设计引物，选择扩增产物比目的片段大150bp~250bp的引物FSL-F/R;所述的花生过敏原Ara h I的基因为:Ara h 1-F: CTGGAAACCTTGAACTCGT,Ara h 1-R: GTTGATGGCTACTGGATGA ； 所述的内参基因FSL R2-561的引物序列为:FSL-F: TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC,FSL-R: CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA ； b.选取步骤a所得的内参基因的引物FSL-F/R的5’末端的8个碱基与花生过敏原引物Ara hl-F/R的3’末端相连，得到27bp的长引物IAC-F/R，该长引物的序列为:IAC-F: CTGGAAACCTTGAACTCGTTAGCCAAC,IAC-R:GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT ； c.以步骤a所得内参基因FSLR2-561基因为模板，以步骤a所得FSL-F/R为引物，进行PCR扩增，得到351bp的PCR产物；以该PCR产物为模板，步骤b所得长引物IAC-F/R为引物，进行PCR扩增，得到389bp的PCR产物即IAC片段； d.将步骤c所得IAC片段进行P·CR扩增，将扩增产物进行割胶回收，连接到载体PMD18-T Simple Vector，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，提取质粒，即得到检测花生过敏原用扩增内标。上述的检测花生过敏原用扩增内标在检测花生过敏原中的应用。[0011 ] 所述扩增内标对PCR检测方法的影响及其灵敏度，首先需通过PCR扩增得到扩增内标的检测限，接着在花生过敏原PCR检测体系中分别添加扩增内标检测限4倍、2倍和I倍的扩增内标，评价扩增内标对花生过敏原PCR检测方法的影响并确定该方法的灵敏度。因为扩增内标与花生DNA在PCR反应体系中竞争同一对引物，所以需要对扩增内标的添加量进行优化，在确保内标能够清晰指示假阴性时，尽量选择较低浓度，使其对PCR方法的灵敏度的影响降到最低。所述PCR检测方法的特异性，以高粱、玉米、大麦、小麦、荞麦、燕麦、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、苹果、梨、虾、蟹、生蚝、鱼、牛奶等常见的动、植物DNA为模板，评价基于扩增内标的花生过敏原PCR检测方法的特异性。本专利技术基于扩增内标的花生过敏原PCR检测方法，具有下列优点: (I)特异性好，不与其他样品DNA发生交叉反应。本专利技术基于扩增内标的花生过敏原PCR检测方法，将常见的动、植物过敏原用于特异性实验，结果没有发生交叉反应，只有花生DNA出现了特异性的目的条带，其他样品DNA只有内标条带，说明该方法的特异性好。(2)灵敏度较高，可以检测微克级别的花生。本专利技术基于扩增内标的花生过敏原PCR检测方法，扩增内标的添加不影响PCR方法的检测灵敏度，灵敏度实验表明该PCR方法的灵敏度为0.4叩花生0嫩，相当于4.97 μ g花生，可检测微克级的花生，说明该方法的灵敏度较高。(3)结果判定准确、可靠，可有效排除可能存在的假阴性。本专利技术基于扩增内标的花生过敏原PCR检测方法，将扩增内标添在至PCR体系中，一方面不影响PCR方法的灵敏度，另一方面，可以有效指示假阴性，提高PCR结果的准确性。应用于实际商品时，有6种商品的PCR扩增受到抑制，通过改进DNA提取方法和对提取DNA进行稀释处理，有3种商品能够检测出花生成分，说明该PCR方法可以有效排除存在的假阴性，提高PCR检测方法的可靠性，具有一定的应用价值。【附图说明】图1是内参基因为模板，FSL-F/R为引物得到351bp的PCR产物； 图2是图1中的PCR产物为模板，长引物IAC-F/R为引物得到的扩增产物； 图3是IAC构建示意图； 图4是IAC的检测限； 图5是IAC添加量的选择；其中A-C图:IAC的量分别为IAC检测限的4倍、2倍、I倍；1-6 花生 DNA 依次为 50、10、2、0.4,0.08 (ng)及空白。图6是PCR检测方法的特异性；1-22分别为花生、高粱、玉米、大麦、小麦、荞麦、燕麦、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、苹果、梨、虾、蟹、生蚝、鱼、牛奶DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测花生过敏原用扩增内标，其特征在于该扩增内标基因的序列为SEQ?ID?NO.1所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.一种检测花生过敏原用扩增内标，其特征在于该扩增内标基因的序列为SEQ IDN0.1所不的喊基序列。2.—种构建根据权利要求1所述的检测花生过敏原用扩增内标的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.通过BLAST比对，选择与花生过敏原Arah I基因同源性较低的单增李斯特菌FSLR2-561基因(NC_017546 )作为内参基因，根据内参基因的序列设计引物，选择扩增产物比目的片段大150bp~250bp的引物FSL-F/R;所述的花生过敏原Ara h I的基因为:Ara h 1-F: CTGGAAACCTTGAACTCGT,Ara h 1-R:GTTGATGGCTACTGGATGA ； 所述的内参基因FSL R2-561的引物序列为:FSL-F: TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC,FSL-R: CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA ； b.选取步骤a所得的内参基因的...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡琴，陈沁，张文举，关潇，邓志瑞，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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