肥胖症大鼠动物模型和构建方法技术

本发明专利技术涉及肥胖症大鼠动物模型和构建方法，属于动物基因工程和遗传修饰领域，主要通过CRISPR/Cas9技术获得LEP和LEPR基因敲除的大鼠，LEP和LEPR基因敲除大鼠具有典型肥胖特征，可为人类肥胖疾病研究提供一种可靠的动物模型，有望成为肥胖大鼠的一种标准化实验动物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物基因工程和遗传修饰领域，具体的说，涉及一种基于基因敲除技术建立的肥胖症疾病大鼠动物模型和构建方法。
技术介绍
随着生活水平的提高，肥胖症(obesity)作为一种慢性病，发病率急剧升高，成为世界性的医疗难题。肥胖症还与糖尿病关系密切，40岁以上的糖尿病患者中有70％～80％在患病前已有肥胖症。同时，肥胖症还伴有高脂血症、高血压、糖耐量异常等症状，并成为动脉硬化的主要诱因。Leptin(Lep)是1994年发现的一种由脂肪细胞分泌的激素。通过中枢神经系统的Leptin受体(Lepr)，Lep可以调控包括血糖浓度、神经内分泌、体重、食欲等多种生理功能和个体行为。目前的研究表明，Lep对体重的调控主要是通过GABA能神经元起作用的；而Lep在下丘脑的不同部位起到不同的作用：青春期葡萄糖稳态的调控在腹侧前乳头核；与重度肥胖症及胰岛素抗性则发生在弓形核中的表达亲阿黑皮素原(POMC)的神经元中。由于Lep及Lepr在糖、脂代谢中的重要作用，已经有多种针对它们及其介导途径的临床药物研究。其中小鼠模型是使用最为广泛的模型，包括针对Lep的ob/ob小鼠模型和针对Lepr的db/db小鼠模型。与小鼠相比，大鼠是研究营养学的常用模式生物。然而，由于种种原因，目前为止只有对应于db/db 小鼠(Lepr缺陷)的大鼠模型，而尚无对应ob/ob小鼠(Lep缺陷)的大鼠模型。不仅如此，以前建立的模型不仅有定点突变，还包括自发突变等随机方法，因此不利于系统阐述基因突变导致的功能缺失。还需要指出的是，以往的建模方法也很难建立多种基因同时突变的模型来研究基因之间的相互关系。基因修饰动物(包括人源化动物)是研究生物医学领域中的分子机理和致病机制的重要研究手段。传统的转基因动物制作方法需要得到相应动物的干细胞，显微注射改造的遗传物质后将干细胞植入囊胚，直至生产出嵌合型动物，并通过杂交最终得到纯合型动物。整个过程不但耗时，而且由于缺乏各种动物的干细胞系，转基因动物的工作主要在小鼠中开展。虽然转基因小鼠的研究对于研究人类疾病有着重要作用，却不能完全模拟人类疾病的真实情况。新的CRISPR技术为制作转基因技术提供了一个崭新的平台。在最新报道中，Wang et al利用CRISPR/Cas系统直接改造受精卵的遗传物质，并通过辅助生殖技术得到靶向基因修饰动物。这项工作使整个工作缩短到一个月，而且可以同时对两个或多个基因同时进行修饰。基于上述依据，本项专利用CRISPR/Cas系统同时敲除Lep两个等位基因，得到相应的靶向基因修饰的大鼠模型。本研究不仅可以加深对肥胖症发病过程中基因调控的认识，而且可以为转化医学和新药研发提供高水平的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肥胖症大鼠动物模型，是利用CRISPR/Cas9技术获得LEP/LEPR特异型基因敲除的大鼠。本专利技术首先提供了大鼠LEP基因第2外显子和LEPR基因第2和第3外显子在制备肥胖症大鼠动物模型中的用途。所述大鼠LEP基因第2外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5：5’-GTCCAAGAAGAAGAAGAAGA CCCCAGCGAG GAAAATGTGC TGGAGACCCC TGTGCCGGTTCCTGTGGCTT TGGTCCTATC TGTCCTATGTTCAAGCTGTG CCTATCCACA AAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCA AGACCATTGT CACCAGGATC AATGACATTTCACACACG-3’所示，所述大鼠LEPR基因第2外显子的核苷酸序列SEQ ID NO.6：5’-GTGTCTATCT CTGAAGTAAG ATGACGTGTC AGAAATTCTA TGTGGTTTTG TTACACTGGG-3’所示；所述大鼠LEPR基因第3外显子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.7所示。本专利技术提供了大鼠LEP基因第2外显子和大鼠LEPR基因第2外显子和第3外显子的sgRNA在敲除大鼠LEP基因中的应用。本专利技术还提供了含有针对上述sgRNA的DNA序列的载体。在本专利技术的实施例中，提供的上述载体为pX330。特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体，由载体pX330和与载体pX330连接的靶向DNA构成，靶向DNA序列为Seq ID No1-ss和Seq ID No1-as、Seq ID No2-ss和Seq ID No2-as、Seq ID No3-ss和Seq ID No3-as、Seq ID No4-ss和Seq ID No4-as中的一对序列。所述Seq ID No1-ss和Seq ID No1-as、Seq ID No2-ss和Seq ID No2-as分别针对LEP基因第2外显子的gRNA靶点，Seq ID No3-ss和Seq ID No3-as针对LEPR基因第2外显子的gRNA靶点，Seq ID No4-ss和Seq ID No4-as针对LEPR基因第3外显子的gRNA靶点。本专利技术提供了用于敲除大鼠LEP或LEPR基因的CRISPR-Cas9表达系统，含有特异性靶向LEP基因第2外显子或LEPR基因第2或第3外显子的sgRNA的表达载体，pX330载体能表达Cas9 mRNA。本专利技术还提供肥胖症大鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：(1)构建特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体；(2)通过体外转录分别表达得到LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA，以及Cas9 mRNA；(3)将sgRNA和Cas9 mRNA纯化后，混合，注射入大鼠受精卵细胞中，移植入大鼠输卵管中，以生产敲除LEP或LEPR基因的动物。步骤(2)转录产生的Cas9 mRNA和sgRNA分别进行吸附柱纯化，将纯化后的Cas9 mRNA和sgRNA分别利用分光光度计测定浓度。步骤(3)中，sgRNA与Cas9 mRNA混合时，二者的质量比为1:2。本专利技术提供了一种肥胖症大鼠动物模型，通过以下检测指标验证：(1)Lep/Lepr基因敲除大鼠的进食量和饮水量增加、体重较大；(2)血清中甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、胰岛素和葡萄糖水平升高；(3)肝脏、肾脏和睾丸等组织异常。本专利技术还提供一种非人类哺乳动物细胞，细胞内含有构建方法步 骤(2)得到的sgRNA和Cas9 mRNA。本专利技术涉及肥胖症大鼠动物模型和构建方法，主要通过CRISPR/Cas9技术获得LEP和LEPR基因敲除的大鼠，LEP和LEPR基因敲除大鼠具有典型肥胖特征，为人类肥胖疾病研究提供一种可靠的动物模型，有望成为肥胖大鼠的一种标准化实验动物。附图说明图1为利用CRISPR/Cas9技术建立Lep基因突变大鼠的示意图；图2图示了Lep突变引起的肥胖、糖耐受和高胰岛素血症；图3为分别对Lep野生型大鼠和Lep突变大鼠的肝脏、肾脏和睾丸等组织进行HE染色，结果显示突变大鼠患有脂肪肝、肾病和不孕等症状。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体，其特征在于：由载体pX330和与载体pX330连接的靶向DNA构成，靶向DNA序列为Seq ID No1‑ss和Seq ID No1‑as、Seq ID No2‑ss和Seq ID No2‑as、Seq ID No3‑ss和Seq ID No3‑as、Seq ID No4‑ss和Seq ID No4‑as中的一对序列。

【技术特征摘要】
1. 特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体，其特征在于：由载体pX330和与载体pX330连接的靶向DNA构成，靶向DNA序列为Seq ID No1-ss和Seq ID No1-as、Seq ID No2-ss和Seq ID No2-as、Seq ID No3-ss和Seq ID No3-as、Seq ID No4-ss和Seq ID No4-as中的一对序列。2. 根据权利要求1所述的特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体，其特征在于：所述 Seq ID No1-ss和Seq ID No1-as、Seq ID No2-ss和Seq ID No2-as分别针对LEP基因第2外显子的gRNA 靶点，Seq ID No3-ss和Seq ID No3-as针对LEPR基因第2外显子的gRNA靶点， Seq ID No4-ss和Seq ID No4-as针对LEPR基因第3外显子的gRNA靶点。3.肥胖症大鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：(1) 构建权利要求1或2所述的特异性靶向LEP基因第2外显子或者LEPR基因第2或3外显子的sgRNA的表达载体；(2) 通过体外转录分别表达得到LE...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝献民，范国平，曾维鸣，
申请(专利权)人：苏州瑞奇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32