一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及角膜基质替代物领域，公开了一种脱细胞角膜组织及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。本发明专利技术还提供了所述脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应用。本发明专利技术的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基质不变性的前提下使得脱细胞角膜组织能够长期湿态保存。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及角膜基质替代物领域，公开了一种脱细胞角膜组织及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。本专利技术还提供了所述脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应用。本专利技术的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基质不变性的前提下使得脱细胞角膜组织能够长期湿态保存。【专利说明】一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用
本专利技术涉及角膜基质替代物领域，具体地，涉及一种脱细胞角膜组织及其制备方 法和应用。
技术介绍
角膜位于眼球最表面，直接与外界接触，容易受到损伤（物理、化学）和感染，一旦 发生病变则会发生混浊而影响视力，甚至致盲。常见的角膜病变有角膜炎、角膜溃疡、圆锥 角膜、角膜软化症和角膜变性等。据世界卫生组织（WHO)统计，目前全世界有角膜病盲患者 近5000万人，我国有约400万人。角膜病严重影响了患者们的正常生活、工作与学习，生活 上需要家人和社会的照顾，增加了家庭的经济负担，也加重了全社会的负担。角膜移植是角 膜病盲患者恢复视力和复明的唯一希望，但由于我国角膜捐献数量极其有限，全国每年能 进行的角膜移植手术目前仅有3000余例，致使绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而 无法重见光明。 目前，国内外同类产品主要以羊膜、胶原及其他合成高分子材料用于角膜移植研 宄，但都存在不同的缺陷。羊膜相对较薄，仅适用于治疗眼表浅度损伤。合成材料的透明性 和稳定性较差，在降解过程中降解产物可引起局部PH值下降，术区出现非特异性无菌性炎 症反应率较高。胶原是组织工程常用的材料，但纯胶原韧性差，易碎，降解过快，手术后一段 时间内就发生碎裂，无法达到复明的效果，因此目前仍停留在基础研宄阶段。相比而言，异 种角膜基质材料来源丰富，具有与正常角膜基质相似的组织结构，移植之后角膜基质的厚 度、屈光度不变。天然的角膜基质层存在着某些生长因子，可促进细胞的生长、繁殖和分化， 而且免疫原性低，神经可以长入，有利于角膜知觉的恢复。此外，由于异种移植供体来源的 动物，如猪，在生理上与人类具有高度相似性，故其组织或器官被认为是理想的供体之一， 以猪作为异种移植供体来源的研宄比较深入，猪的组织器官（如心脏瓣膜、胰岛细胞、凝血 因子等）已用于人类疾病的治疗，异体脱细胞真皮基质已被批准用于临床。猪角膜基质含 有角膜细胞生长所必需的多种细胞外基质成分，具有良好的生物相容性，能够成为有效的 角膜基质替代物。 异种移植供体来源的动物（如猪）的角膜基质组织中含有自身固有的细胞，需经 过脱细胞处理才能获得无免疫原性或免疫原性较低的角膜基质替代物。现有的角膜基质 替代物主要通过将动物源性角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌 处理获得，且酶消化一般采用含有胰酶的缓冲液进行处理。这样的方法对制备得到的角膜 基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较 低，并不能完全满足临床移植的要求，而且无法长期湿态保存。 因此，研发一种能够完全脱除异种移植供体来源的动物（如猪）角膜基质中的细 胞成分，对胶原板层结构破坏极小，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列 整齐、孔隙均匀规则、透光率较高且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿态保存的角膜 基质替代物的制备方法，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结 构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，透光率较低，并不能完全满足临床移 植要求且无法长期湿态保存的缺陷，提供一种胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则、板层结构 保留完整、透光率较高且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿态保存的脱细胞角膜组织 及其制备方法和应用。 因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种脱细胞角膜组织的制备方 法，所述方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、 反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲 液进行处理。 第二方面，本专利技术提供了所述方法制备得到的脱细胞角膜组织。 第三方面，本专利技术还提供了所述脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应 用。 本专利技术的脱细胞角膜组织，来源丰富，生物相容性及生物安全性好，胶原纤维排列 整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，且在角膜基质不变性的 前提下能够长期湿态保存；理化性能良好，角膜透光率为70% -80% ;机械强度高，能够耐 受手术缝线牵拉、韧性良好并能长期应用于临床，主要用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、 疤痕、化学或热烧伤等致盲性眼病，将病变处被损坏的角膜切除并将同样尺寸的板层角膜 基质支架植入患者眼中，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。 本专利技术的方法具有以下特点： 1)本专利技术方法的工艺流程简单可靠，周期短。 2)本专利技术方法采用的原料来源广泛，成本低，使用方便。 3)本专利技术的方法，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列 整齐，无细胞残留，前弹力层及基底膜都保留，便于上皮层的生长，提高了脱细胞角膜组织 的生物相容性。 4)本专利技术方法制备得到的脱细胞角膜组织，在使用前用生理盐水或PBS缓冲液清 洗后即可使用而无需进行复水处理，使用方便，且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿 态保存，可长达6个月。 5)本专利技术方法制备得到的脱细胞角膜组织，通过自检、型式检验验证了该产品的 安全性，结果显示其机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植的要求。 6)本专利技术方法制备得到的脱细胞角膜组织，适合用于基质层异常角膜的临床移 植，使众多角膜基质异常患者重见光明成为可能，为组织工程角膜产业提供了重要的技术 支持。 本专利技术的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。 【专利附图】【附图说明】 图1是本专利技术实施例1制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。 图2是正常人角膜板层结构的冰冻切片图。 图3是本专利技术实施例5制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。 图4是本专利技术实施例6制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。 图5是本专利技术对比例1制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。 图6是本专利技术对比例2制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。 【具体实施方式】 以下对本专利技术的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。 第一方面，本专利技术提供了一种脱细胞角膜组织的制备方法，所述方法包括：将在无 菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、 灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。 根据本专利技术的方法，本领域技术人员可以理解的是，在无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞角膜组织的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝泉，李青，
申请(专利权)人：青岛中皓生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37