一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种板层角膜基质支架及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。本发明专利技术还提供了所述板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。本发明专利技术的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性。

【技术实现步骤摘要】
一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用
本专利技术涉及角膜基质替代物领域，具体地，涉及一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用。
技术介绍
角膜位于眼球最表面，直接与外界接触，容易受到损伤(物理、化学)和感染，一旦发生病变则会发生混浊而影响视力，甚至致盲。常见的角膜病变有角膜炎、角膜溃疡、圆锥角膜、角膜软化症和角膜变性等。据世界卫生组织(WHO)统计，目前全世界有角膜病盲患者近5000万人，我国有约400万人。角膜病严重影响了患者们的正常生活、工作与学习，生活上需要家人和社会的照顾，增加了家庭的经济负担，也加重了全社会的负担。角膜移植是角膜病盲患者恢复视力和复明的唯一希望，但由于我国角膜捐献数量极其有限，全国每年能进行的角膜移植手术目前仅有3000余例，致使绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法重见光明。目前，国内外同类产品主要以羊膜、胶原及其他合成高分子材料用于角膜移植研究，但都存在不同的缺陷。羊膜相对较薄，仅适用于治疗眼表浅度损伤。合成材料的透明性和稳定性较差，在降解过程中降解产物可引起局部PH值下降，术区出现非特异性无菌性炎症反应率较高。胶原是组织工程常用的材料，但纯胶原韧性差，易碎，降解过快，手术后一段时间内就发生碎裂，无法达到复明的效果，因此目前仍停留在基础研究阶段。相比而言，异种角膜基质材料来源丰富，具有与正常角膜基质相似的组织结构，移植之后角膜基质的厚度、屈光度不变。天然的角膜基质层存在着某些生长因子，可促进细胞的生长、繁殖和分化，而且免疫原性低，神经 可以长入，有利于角膜知觉的恢复。此外，由于异种移植供体来源的动物，如猪，在生理上与人类具有高度相似性，故其组织或器官被认为是理想的供体之一，以猪作为异种移植供体来源的研究比较深入，猪的组织器官(如心脏瓣膜、胰岛细胞、凝血因子等)已用于人类疾病的治疗，异体脱细胞真皮基质已被批准用于临床。猪角膜基质含有角膜细胞生长所必需的I型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质成分，具有良好的生物相容性，能够成为有效的角膜基质替代物。异种移植供体来源的动物(如猪)的角膜基质组织中含有自身固有的细胞，需经过脱细胞处理才能获得无免疫原性或免疫原性较低的角膜基质替代物。现有的角膜基质替代物主要通过将动物源性角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理获得，且酶消化一般采用含有胰酶的缓冲液进行处理。这样的方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较低，并不能完全满足临床移植的要求。因此，研发一种能够完全脱除异种移植供体来源的动物(如猪)角膜基质中的细胞成分，对胶原板层结构破坏极小，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则且透光率较高的角膜基质替代物的制备方法，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较低，并不能完全满足临床移植要求的缺陷，提供一种胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则且透光率较高的板层角膜基质支架及其制备方法和应用。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，在制备板层角膜基质支架时，采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行酶消化处理，并在酶消化处理之后干燥处理之前进行超声处理，不仅能够完全脱除角膜基质中的细胞成分，而且能够最大程度地减少对角膜基质胶原板层结构的破坏，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则、透光率高，与人角膜基质细胞具有理想的生物相容性，能够最大程度地满足移植要求。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。第二方面，本专利技术提供了所述方法制备得到的板层角膜基质支架。第三方面，本专利技术还提供了所述板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。 本专利技术的板层角膜基质支架，来源丰富，生物相容性及生物安全性好，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整；理化性能良好，角膜透光率为70% -80% ;机械强度高，能够耐受手术缝线牵拉、韧性良好并能长期应用于临床，主要用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、疤痕、化学或热烧伤等致盲性眼病，将病变处被损坏的角膜切除并将同样尺寸的板层角膜基质支架植入患者眼中，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。本专利技术方法中，为了最大程度地使支架材料满足移植要求，对各步骤的条件包括时间、温度、酶种类选择及酶浓度、超声频率及超声时间等进行了详细周密的设计和严格反复的验证。通过一系列实验的优化，使本专利技术的方法具有以下特点:I)本专利技术方法的工艺流程简单可靠，周期短。2)本专利技术方法采用的原料来源广泛，成本低，使用方便。3)本专利技术的方法，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，无细胞残留，前弹力层及基底膜都保留，便于上皮层的生长，提高了支架材料的生物相容性。4)本专利技术方法制备得到的板层角膜基质支架，通过自检、型式检验验证了该产品的安全性，结果显示其机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植的要求。5)本专利技术方法制备得到的板层角膜基质支架，适合用于基质层异常角膜的临床移植，使众多角膜基质异常患者重见光明成为可能，为组织工程角膜产业提供了重要的技术支持。本专利技术的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。【附图说明】图1是本专利技术实施例1制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。图2是正常人角膜板层结构的冰冻切片图。图3是本专利技术对比例I制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。图4是本专利技术对比例2制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。【具体实施方式】 以下对本专利技术的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。第一方面，本专利技术提供了一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，其中，酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。根据本专利技术的方法，本领域技术人员可以理解的是，在无菌条件下切取角膜基质片前，一般先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS缓冲液可以为I XPBS缓冲液。对于酒精和妥布霉素的浓度以及浸泡时间没有特别的要求，可以为本领域常用的浓度和浸泡时间。优选情况下，酒精的体积百分浓度为70-80%，进一步优选为75% ;妥布霉素的浓度为30000-50000U/L，进一步优选为40000U/L ;浸泡时间为10_30s。对于切取的角膜基质片的直径和厚度没有特别的要求，可以为本领域常规的角膜基质片的直径和厚度。优选情况下，切取的角膜基质片的直径为8-10mm，厚度为200-600 μ mD为了提高制得的板层角膜基质支架和人角膜基质细胞的生物相容性，优选情本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。

【技术特征摘要】
1.一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶消化处理的条件包括:DNA酶与缓冲液的体积比为1:500-1500, RNA酶与缓冲液的体积比为1:1500-2500，温度为30_40°C，时间为2—4h03.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超声处理的条件包括:温度为20-40°C，超声功率为200-500W，超声时间为2-5h。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述在无菌条件下切取新鲜动物眼球的角膜基质片的方法包括:先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在无菌条件下切取角膜基质片；所述酒精的体积百分浓度优选为70-80%，所述妥布霉素的浓度优选为30000-50000U/L，所述浸泡时间优选为10_30s ;所述切取的角膜基质片的直径优选为8-10mm，厚度优选为200-600 μ m ;所述动物优选为猪、牛或猴...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青，王宝泉，彭艳婷，王红梅，李海燕，
申请(专利权)人：青岛中皓生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37