处理猪角膜以脱细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于处理猪角膜的方法，所述方法使用ＮａＣｌ水溶液和胰蛋白酶／ＥＤＴＡ水溶液对摘出的猪角膜脱细胞化。通过所述方法处理的猪角膜既不会引起炎症也不会引起免疫排斥。通过所述方法脱细胞化的猪角膜基质可以在移植后与宿主角膜细胞一起再细胞化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及处理猪角膜的方法，更具体而言，涉及。
技术介绍
角膜是折射光线的器官，其占眼球最外层膜的六分之一。角膜总共由五个层构成， 即，角膜上皮层、鲍曼氏膜(Bowman' s membrane)、角膜基质层(也称作固有质层)、戴氏膜 (Descemet' s membrane)和角膜内皮层。角膜上皮由5至6层细胞构成。角膜上皮的基 底细胞来自边缘的干细胞，向角膜的中心迁移并在7日内脱落。鲍曼氏膜由非细胞的胶原 纤维构成，并且是无色透明的。然而，鲍曼氏膜不能再生，在外科手术或外伤伤害时通常会 出现疤痕。角膜基质占角膜厚度的约90%，并具有均勻排列的尺寸一致的细胞。戴氏膜由 3至4层细胞构成，并被认为是角膜内皮细胞的基膜。角膜内皮是单层细胞，由特化的内皮 细胞构成，在再生方面被严格限制，并且其细胞数量随年龄减少。当细胞数量减少时，细胞 尺寸增加以填补空隙。同时，因角膜透明性丧失而导致的角膜盲是仅次于白内障的引起视力丧失的主要 原因。眼外伤和角膜溃疡每年使150万 200万的人们失明。对于这种失明唯一有效的治 疗是移植人类供体角膜(也称作“角膜移植术”)。供体角膜的短缺使得需要异体移植的替 代方式。关于角膜置换已经进行了大量研究。合成置换材料包括人工角膜和天然角膜等材 料，这些材料使用培养的细胞和细胞外基质(ECM)进行组织工程化。然而，目前，这些材料因与生物相容性和光学及机械性质有关的问题而没有得到 广泛应用，而利用其它动物角膜代替人类角膜的异种移植是发展最快的方法。猪角膜是最具前景的人类角膜置换物，因为它们具有与人类角膜相当的折射率和 尺寸，将猪用于移植被认为是伦理学可接受的，并且基因修饰的猪(例如，α_1，3-半乳糖 基转移酶敲除猪和hDAF转基因猪)已被开发并最终进入了临床实践。然而，传统研究报道了角膜全厚度异种移植会引发严重的免疫排斥。另外， 本专利技术人报道的研究显示，即使在不存在角膜内皮的情况下，板层角膜异种移植也 会遭遇免疫排斥 0这意味着角膜细胞(角膜基质细胞)也可以引起免疫排斥。因此，本专利技术的专利技术人考虑到，对于具有正常内皮细胞但患有基质浑浊的患者，无 细胞的猪角膜基质(已经脱去细胞)可用作板层角膜异种移植的供体组织。此外，角膜移 植的新近范式已经由置换整个区域的全厚度角膜移植改变为仅置换病变区域的部分厚度 的角膜移植。所述方法被认为在临床实践中更为有用。有大量无细胞生物材料被用于修复各种器官中的缺陷，并且研究了各种脱细胞方法。然而，关于对角膜基质脱细胞的方法还没有进行深入研究，特别是关于有效处理 角膜同时减小移植后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法还没有进行研究。
技术实现思路
因此，鉴于上述问题进行了本专利技术，本专利技术的一个目的是提供有效处理角膜同时 减小角膜移植术后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法。根据本专利技术，上述和其它目的可以通过提供处理猪角膜的方法而实现，所述方法 包括将摘出的猪角膜浸入NaCl水溶液中；将该猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和 洗涤该猪角膜。NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液的使用能够较少免疫反应和炎症，有助于脱 细胞。NaCl水溶液可以含有1. OM 2. OM NaCl。将猪角膜浸入NaCl水溶液中的步骤可以在35°C 39°C的温度进行12小时 36 小时。胰蛋白酶/EDTA水溶液可以含有0.01% 0. 10% (w/v)的胰蛋白酶和0.01% 0. 05% (w/v)的 EDTA。将猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步骤可以在35°C 39°C的温度进行36 小时 60小时。洗涤可以使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为洗涤液来进行。 附图说明通过以下详细描述并结合附图，本专利技术的上述和其它目的、特征及其它优点将会 得到更加清楚的理解，附图中图1是下述各组的猪角膜的图像未处理的对照组(A)、3次冻融组(B)、高渗盐水 (hypertonic saline) (C)(hyperosmolar glycerol) (D)、月夷胃白散酶(Dispase)/SDS组(E)和DNase/RNase组(F)。3次冻融组、高渗盐水组和高渗透甘油 组的角膜保持光学透明性，而胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组的角膜失去了光 学透明性；图2显示了来自下述各组的苏木精_曙红染色的猪角膜对照组(A)、3次冻融组 (B)、高渗盐水组(C)、高渗透甘油组(D)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(E)和DNase/RNase组 (F)。3次冻融组、高渗盐水组、高渗透甘油组和胰蛋白酶/分散酶/SDS组几乎不具有细胞， 而DNase/RNase组具有严重变形的胶原，且不具任何细胞结构；图3显示了下述各组的猪角膜的TUNEL测试结果对照组(A)、冷冻组(B)、3次 冻融组(C)、高渗盐水组(D)、高渗透甘油组(E)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(F)和DNase/ RNase组(G)。对照组和冷冻组不具有凋亡细胞。另一方面，高渗透甘油组和胰蛋白酶/分 散酶/SDS组具有许多凋亡细胞；图4是下述各组的猪角膜的透射电子显微镜(TEM)图像对照组(A，B)、3次冻融 组(C，D)、高渗盐水组(E，F)、高渗透甘油组(G，H)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(I，J)和DNase/RNase组(K，L)。对照组具有在结构良好的胶原束之间的正常角膜细胞。另一方面， 其它组的角膜具有严重受损的细胞。胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组具有过 于破碎的胶原纤维且没有细胞结构；图5显示了由正常角膜培养的猪角膜细胞(A，B，C)的形态和由冻融三次的角膜培 养的猪角膜细胞(D，E，F)的形态。与正常角膜相比，3次冻融的猪角膜在术后1周(A，D)、 2周(B，E)和3周(C，F)生长了较少的细胞；图6是兔角膜的图像，在所述兔角膜中板层移植了猪角膜。新鲜的猪角膜(对照 组)至术后2周㈧仍保持透明性，但是在术后4周⑶显示排斥反应。冷冻的猪角膜(冷 冻组)在术后1个月(C)也显示了排斥反应，并且高渗透甘油处理的角膜(高渗透甘油组) 较早开始发炎且变得不透明(D)。移植后，胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组(分 别为E，F)发生了融合。(G)和(H)分别显示移植后1个月(G)和移植后2个月(H)的3次 冻融组的猪角膜。此外，高渗盐水组的角膜即使在2个月(L)和6个月(I)后还保持透明 性；图7显示了由猪至兔的板层移植1个月后的苏木精-曙红的染色结果。对照组具 有炎性细胞向供体移植连接处的严重的浸润(A)。在冷冻组(B)、3次冻融组(C)和高渗透 甘油组(D)中也观察到许多炎性细胞。另一方面，高渗盐水组的移植物没有炎性细胞，并且 在移植后1个月(E)和移植后6个月(F)中被再细胞化(recellularized)；图8显示了⑶3+和Hoechst 33342免疫组织化学染色。在术后一个月显示排斥 反应的对照组的移植物中观察到许多⑶3+细胞(A)，而高渗盐水组的猪角膜移植物不具有 ⑶3+细胞(B)。术后1个月在整个高渗盐水处理的移植物中观察到Hoechst 33342染色的 角膜细胞(D)。在此情况中，所述角膜细胞的数量与正常的兔角膜基质相当；图9是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种处理猪角膜的方法，所述方法包括：将摘出的猪角膜浸入ＮａＣｌ水溶液中；将所述猪角膜浸入胰蛋白酶／ＥＤＴＡ水溶液中；和洗涤所述猪角膜。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2009-3-4 10-2009-0018294一种处理猪角膜的方法，所述方法包括将摘出的猪角膜浸入NaCl水溶液中；将所述猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和洗涤所述猪角膜。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述NaCl水溶液含有1.OM 2. OM的NaCl。3.如权利要求2所述的方法，其中，将所述猪角膜浸入NaCl水溶液中的步骤在35°C 3...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏元良，金美昑，吴周娟，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]