表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法技术

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，包括如下步骤：鼠尾胶原的制备、人成纤维细胞的培养、表皮干细胞的培养、复方壳多糖组织工程皮肤的制备与观察、复方壳多糖组织工程凝胶的制备与观察。本发明专利技术证实了在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的表皮生长因子(EGF)诱导、垂直振荡培养，能形成管腔样结构，且所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相似的生理结构及生理作用基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞的分离和培养方法，特别涉及一种表皮干细胞向汗腺样上皮 细胞分化的方法。
技术介绍
严重的皮肤缺损，如大面积的深度烧伤等，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面 自身难以实现皮肤再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。目前构建的表真皮双层组织 工程皮肤虽已应用于临床，基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的皮肤组织结构和 功能的完全重建，其最大的问题是缺乏皮肤附件，如皮脂腺、汗腺等附属器。表皮干细胞 (Epidermalstemcell,ESC)是皮肤组织特异性干细胞，位于表皮基底层，在维持表皮更 新，保持细胞恒定等方面起着重要作用。表皮干细胞具有多向分化潜能，体内证实能够向皮 肤附属器及表皮分化。若能在体外诱导表皮干细胞向汗腺分化，将为研究带汗腺的组织工 程皮肤提供重要实验依据。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种表皮干细胞向汗腺样 上皮细胞分化的方法。 为了实现上述专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案： -种，包括如下步骤： 1)鼠尾胶原的制备 将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D-Hanks液冲洗，抽出尾 腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取 上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用； 2)人成纤维细胞（FB)的培养 将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，用PBS液反复冲洗；去除 皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上 揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，再加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着 取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待 原代培养的FB接近或达到融合后，用0. 25%胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收 缩裂隙时，用含10%FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照 1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。 3)表皮干细胞的培养 先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤： a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本 发白发涨； b)将上述步骤a)中的人包皮标本在培养皿中剪去皮下组织后剪成长方形的条 状，然后进行分离消化； C)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，然后对人包皮标本的表皮和真 皮进行分离，再将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再 放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5XIO4/孔接种在 预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴 壁率，并每天更换K-SFM培养液； 再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤： d)待原代表皮干细胞融合约70 %后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤； e)每孔加入0. 25%膜蛋白酶后放入冰箱，保持在4C; f)待4-6h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10%FBS的DMEM中和； g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心； h)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用； 4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备 按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM; 再用氢氧化钠调节pH值至7. 2-7. 4 ;在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到IO5Ail;吸入多孔 培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8X105/ml的1代表皮干细胞， 最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养， 将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加20ng/mlEGF;两组均每 日垂直振荡；待培养16天后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况； 5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备 按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DiffiM; 再用氢氧化钠调节pH值至7. 2-7. 4 ;在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8XIO5Ail; 吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置孵箱中培养，每天进行换液； 每日垂直振荡；待培养3天后，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF;待培养16天后行组织 学及形态学检查； 6)组织工程凝胶的观察 步骤包括组织学观察、免疫荧光观察、透射电镜下观察以及激光共聚焦显微镜观 察钙通道。 进一步地，所述步骤1)中尾腱保存条件为4°C，保存48h，所得物鼠尾胶原的贮存 条件为4°C。 进一步地，所述各步骤中酒精的浓度均为75%，所述孵箱的条件为37°C、5% C02/95 %空气、90 %以上湿度，所述筛网规格为200目。 进一步地，所述步骤1)中离心条件为3000rpm，离心Ih;所述步骤2)中离心条件 为1500rpm，离心5min;所述步骤3)中离心条件为IOOOrpm,离心5min。 进一步地，所述步骤2)和3)b)中人包皮标本剪成长方形条状的尺寸为 0. 3cmX2cm〇 进一步地，所述步骤3)c)中分离采用0.25%分离酶进行，其中所述分离酶与样本 的比例为5:1，消化采用0. 25%胰蛋白酶进行，其中表皮与所述胰蛋白酶体积比为3:1。 进一步地，所述步骤2)中采用且镊子将表皮从真皮上揭下，弯头镊子刮真皮表 面；所述步骤3)c)中表皮和真皮进行分离采用眼科镊轻轻揭下表皮即完成表皮和真皮的 分离。 进一步地，所述步骤2)中所述FB为第4-10代；所述步骤3)、4)和5)中培养板为 24孔培养板。 进一步地，所述步骤2)中采用CASY?.系统分析细胞体积及增殖情况，所述步骤 3)c)中利用CASY?系统来分析计算细胞活力及细胞数。 进一步地，所述步骤4)和步骤5)中所述的混匀在冰浴条件下进行和所述的垂直 振荡条件为振荡频率为75次/分，振幅为2cm。 由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果至少包括： 本专利技术证实了在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的 EGF(如，20ng/ml)在诱导条件下，垂直振荡培养，能形成管腔样结构，且所形成的管腔样结 构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相 似的生理结构及生理作用基础。 三维细胞培养（Threediamensionscellculture,TDCC)是将细胞培植在一定的 细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM)中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使得细胞能 够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境能最大程度地模拟体内环 境。这种培养方式一方面能够为体外培养细胞提供近似体内的微环境，从而有利于细胞增 殖、迁移和分化；另一方面可在体外构建各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同 物，是基础研究和体外构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)鼠尾胶原的制备将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D‑Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用；2)人成纤维细胞的培养将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，再用PBS液反复冲洗；去除皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代培养的FB接近或达到融合后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。3)表皮干细胞的培养先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤：a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白发涨；b)将上述步骤a)中的人包皮标本剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离消化；c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，对人包皮标本的表皮和真皮进行分离，将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K‑SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×104/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K‑SFM培养液；再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤：d)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤；e)每孔加入0.25％胰蛋白酶后放入冰箱，保持在4℃；f)待4h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心；h)弃去上清液，加入K‑SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用；4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2‑7.4；在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到105/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8×105/ml的1代表皮干细胞，最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加EGF；两组均每日垂直振荡；待培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况；5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2‑7.4；在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8×105/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置孵箱中培养，每天进行换液；每日垂直振荡；待培养3天后，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF；待培养16天后行组织学及形态学检查；6)组织工程凝胶的观察步骤包括组织学观察、免疫荧光观察、透射电镜下观察以及激光共聚焦显微镜观察钙通道。...

【技术特征摘要】
1. 一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 鼠尾胶原的制备 将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D-Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪 碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清 溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用； 2) 人成纤维细胞的培养 将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，再用PBS液反复冲洗；去除皮 下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭 下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出 液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代 培养的FB接近或达到融合后，用0. 25%胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂 隙时，用含10 %FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传 代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。 3) 表皮干细胞的培养 先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤： a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白 发涨； b)将上述步骤a)中的人包皮标本剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离 消化； c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，对人包皮标本的表皮和真皮进行分 离，将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K-SFM 培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5 X 104/孔接种在预先铺满IV 型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天 更换K-SFM培养液； 再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤： d)待原代表皮干细胞融合约70%后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤； e) 每孔加入0. 25 %膜蛋白酶后放入冰箱，保持在4C; f)待4h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10% FBS的DMEM中和； g) 将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心； h)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用； 4) 复方壳多糖组织工程皮肤的制备 按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM;再 用氢氧化钠调节pH值至7. 2-7. 4;在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到105/ml ;吸入多孔培 养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8X105/ml的1代表皮干细胞，最 后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将 组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在K...

【专利技术属性】
技术研发人员：王元元，伍津津，杨亚东，鲁元刚，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85