一种组织工程骨及其制备方法技术

本发明专利技术公开的一种组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片层间的血管内皮细胞构成，n=3~8。其制备方法为：先在细胞培养器皿表面上制备光敏半导体结构层，获得光敏的细胞培养皿；再用光敏的细胞培养皿培养骨髓间充质干细胞，并获取骨髓间充质干细胞片；最后构建由多层骨髓间充质干细胞片及血管内皮细胞构成的多层细胞片叠层化物，经培养获得组织工程骨。本发明专利技术的组织工程骨单纯由同源细胞构成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，对骨缺损的修复及其早期血管化具有重要意义，且本发明专利技术的方法简单易行，便于推广。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开的一种组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片层间的血管内皮细胞构成，n=3~8。其制备方法为：先在细胞培养器皿表面上制备光敏半导体结构层，获得光敏的细胞培养皿；再用光敏的细胞培养皿培养骨髓间充质干细胞，并获取骨髓间充质干细胞片；最后构建由多层骨髓间充质干细胞片及血管内皮细胞构成的多层细胞片叠层化物，经培养获得组织工程骨。本专利技术的组织工程骨单纯由同源细胞构成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，对骨缺损的修复及其早期血管化具有重要意义，且本专利技术的方法简单易行，便于推广。【专利说明】
本专利技术涉及，具体涉及一种由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法，属于组织工程领域。
技术介绍
由于先天畸形、外伤、肿瘤等造成的骨组织缺损和缺失是临床常见的疾病，因此对骨组织缺损的功能性重建修复一直是再生医学的重要课题。传统的治疗方法常采用自体或异体骨移植，但往往因供源有限或免疫排斥反应等而限制了其临床应用。组织工程技术作为目前人工骨替代材料中应用最为广泛的一种，通过其生物可降解性被逐渐替换。如CN103285427A公开的《一种人工骨材料及其制备方法》，即采用适宜比例羟基磷灰石、胶原和纳米纤维素合成人工骨，具有良好的强度及降解性能。CN103157138A公开的《一种组织工程骨修复材料的构建方法》，则采用可注射型壳聚糖-β -磷酸三钙复合骨髓基质干细胞作为组织工程骨，可任意塑形且完全降解吸收，诱导成骨效应明显。然而，常规组织工程技术的细胞粘附主要通过修复区周边细胞的爬行或将相应细胞悬液滴定于材料表面或缺损区，细胞粘附利用率低、修复周期长，其大小、形状及定位也很难控制；同时，滴定细胞悬液往往形成散在岛状修复区，对于大片组织缺损并不适用；另外，应用传统组织工程所构建的生物骨组织植入宿主后其内毛细血管生长缓慢，不利于骨组织的生长、改建及支架材料降解，故构建具有初期血管化的新型组织工程骨对于骨组织的修复及重建具有重要的意义。 细胞薄层培养技术(TangZ, Akiyama Y, Yamato M, Okano T.Comb-typegrafted poly(N-1sopropylacrylamide) gel modified surfaces for rapid detachmentof cell sheet.B1materials (2010) ; 31 (29):7435-43.Nagase K, KobayashiJ, Kikuchi A, Akiyama Y, Kanazawa H, Okano T.Thermally-modulated on/off-adsorpt1n materials for pharmaceutical protein purificat1n.B1materials.(2011) ;32(2):619-27.)作为一种新型组织工程方法，具有其独特的优势。其通过相应中介物质或控制贴壁细胞所生长培养皿底部疏水-亲水转换从而控制细胞成片粘附生长和剥离，此“细胞片”多层叠加或复合培养后，无需包裹材料，本身即可作为一种“生物支架”植入缺损部位。相较胰酶作用获得的细胞，其并未破坏细胞间的蛋白连接及细胞同底部基质间的连接，细胞活性更好；同时，细胞薄层培养技术还可避免降低在组织修复时因使用生物降解支架材料而造成高污染的问题。CN103097518A和CN103180437A公开的《细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法》，即通过温敏细胞培养皿获得细胞片，将多层细胞片叠加形成复层细胞片叠层化物，并将其整体培养于含流路凝胶或动静脉袢构成的血管床上，得到了含血管网的心肌组织。然而，温控的条件相对复杂，对于设备要求较高，温度的间或改变亦影响细胞的活性，加速部分细胞老化，对于温度更为敏感的人成骨类细胞并不适用(Fukumori K, Akiyama Y, Yamato M, KobayashiJ, Sakai K, Okano T.Temperatureresponsive glass coverslips with an ultrathinpoly(N-1sopropylacrylamide) layer.Acta B1mater 2009;5:470-476)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有血管网状结构的由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法。 本专利技术的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由η片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，η=3?8。 制备上述组织工程骨的方法，包括如下步骤:1)制备光敏的细胞培养皿将光响应纳米颗粒分散于去离子水中配成质量浓度为1(Γ20%的分散液，再将分散液与醇和有机溶剂按摩尔比为0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驱体溶液，将前驱体溶液滴至聚苯乙烯培养皿至其铺满，烘干并消毒，得到光敏的细胞培养皿；所述的光响应纳米颗粒为纳米氧化钛、纳米氧化锌或纳米氧化铁，醇为甲醇或乙醇，有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷；2)培养骨髓间充质干细胞片取骨髓间充质干细胞，以5X 14IX 15个/cm2的密度植入步骤I)的光敏的细胞培养皿中，加入骨髓间充质干细胞专用培养基培养4?10天后，采用波长32(T450nm、强度f 4mW/cm2的光从培养皿底部射入，照射至光敏的细胞培养皿中骨髓间充质干细胞成片脱落，获得骨髓间充质干细胞片；3)构建组织工程骨将步骤2)得到的骨髓间充质干细胞片转移至细胞培养皿中，待其贴壁后，加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h后，以5X 10，2X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，再在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，在上述结构上再转移一片骨髓间充质干细胞片，力口入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h ；在上述结构上再以5 X 10^2 X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，再次转移骨髓间充质干细胞片，并加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，重复上述的过程直至该结构具有η层骨髓间充质干细胞片，η=3^8,获得多层细胞片叠层化物，向细胞培养皿内的骨髓间充质干细胞专用培养基中添加成骨细胞诱导因子及成血管细胞诱导因子，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下再培养Γ10天，得到组织工程骨。 所述的成骨细胞诱导因子为抗坏血酸、β_甘油磷酸钠和地塞米松中的一种或多种，其添加量分别可以为抗坏血酸5(Tl00Ug/ml、β -甘油磷酸钠5?1mM及地塞米松 IX ΙΟΛΓ?ιιΜ ;所述的成血管细胞诱导因子为血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，其添加量分别可以为碱性成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织工程骨，其特征在于所述的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，n=3~8。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧明，俞梦飞，洪逸，董灵庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33