表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，即对几丁质膜支架材料进行表面修饰改性后与表皮干细胞共同培养，使表皮干细胞在修饰几丁质膜上均匀地、充分铺展并具有良好的生长状态，以利于表皮干细胞在创面中从毛囊干细胞向表皮细胞分化、并产生毛囊等附属器，完成表皮与真皮修复，从而获得理想的创面修复效果，实现病损组织的形态和结构再生、功能重建，用于皮肤组织工程浅层与全层创面修复，对临床创面的修复具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程皮肤
，尤其涉及一种以几丁质膜作为支架培养表皮干细胞构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途。
技术介绍
大面积创面处理离不开覆盖物，有时甚至需要进行皮肤移植，但自体皮源不足而限制了手术实施。现有技术的人工皮肤研究中，通常使用表皮细胞、成纤维细胞等终末细胞加入支架材料，以构成有一定生物活性的复合皮，但这类终末细胞，增殖能力较弱，影响修复效果。以往组织工程皮肤的种子细胞中，表皮成分主要是来源于自体或异体的表皮细胞， 虽然不断改进培养体系，缩短周期或建立表皮细胞株，但尚无突破性进展。真皮种子细胞主要来源于成纤维细胞，取材方便生长速度较快，但功能单一，对构建皮肤附属器无明显优势。由于表皮干细胞(印idermis stem cells, ESCs)具有很大的可塑性，是潜在的多能干细胞，在合适条件下可诱导形成汗腺、毛发和毛囊等皮肤附属器，从而在解决表皮成分的种子细胞上具有优势。而ESCs的培养及其与载体的结合，是构建组织工程皮肤的关键所在。几丁质膜作为一种生物材料，除了具有良好的组织相容性和生物学性能外，还具有来源广泛、价格低廉、性质稳定及重复性好等优点，是构建组织工程皮肤的较好选择。本专利技术人以几丁质膜作为介质支架，体外与ESCs共同培养，取得了突破性进展，ESCs在几丁质膜纤维1 2w上形成集落，为ESCs作为种子细胞构建仿生覆盖物并实现诱导组织再生、功能重建提供了基础。但仍然存在着以下缺陷几丁质生物膜材料孔径较大(500 IOOOnm)、网格不均勻、致密性差，仅适合用于伤口的暂时性覆盖，不利于细胞的贴附及立体生长，细胞容易遗漏，细胞贴附量有限，从而影响了表皮干细胞分化为表皮细胞的能力，不能很好地促进创面愈合，难以获得理想的创面修复效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种对几丁质膜进行表面修饰改性后与表皮干细胞共同培养构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，使表皮干细胞在支架材料上均勻地、充分铺展并具有良好的生长状态，以利于表皮干细胞在创面中从毛囊干细胞向表皮细胞分化，并产生毛囊等附属器，从而获得理想的创面修复效果，实现病损组织的形态和结构再生、功能重建。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现本专利技术提供的一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法， 采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，包括以下步骤a)表皮干细胞的分离和培养取大鼠或小儿包皮全层皮肤，中性蛋白酶消化过夜，从表皮基底层提取单细胞，洗涤后加入DK-SFM培养液，移至用IV型胶原预包被的培养瓶内，37°C下静置10 15min，贴壁细胞即为表皮干细胞(ESCs)；弃去未贴壁的细胞悬液，加入DK-SFM培养液常规培养，取第2-3代细胞用于实验；b)采用胶原混合液表面修饰几丁质膜b-i)胶原混合液的制备在冰上进行如下操作将无菌10XPBS、无菌蒸馏水、无菌新鲜IN NaOH混合配制平衡液，然后将I型胶原加入所述平衡液混合均勻；其中按照体积比5mg/ml I型胶原10XPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，无菌蒸溜水补足总量，混合后I型胶原的终浓度为0. 25 3mg/ml ；为减少或避免产生气泡，混合采用吸管上下吸勻的方式进行，如出现气泡采用离心方式去除；放置15min获得胶原混合液；b-2)修饰几丁质膜根据模具，几丁质膜裁成呈正方形、且双层十字型放置，在其上加入所述胶原混合液，胶原混合液的添加量为0. 2 0. 4ml/cm2几丁质膜面积，冰上放置30min lh，然后放置在37°C孵育箱45min lh，促进胶体形成；之后在温度-70 -80°C下预冷20h或过夜，-30 -40°C冷冻真空干燥20 25h ；Co60 5 IOKgy辐照，连续3 5次交联并灭菌而获得修饰几丁质膜；所述修饰几丁质膜具有图案式的均勻网格结构，网格孔径为2 IOnm ；c)表皮干细胞-修饰几丁质膜共培养修饰几丁质膜使用时用培养液平衡后待用；贴壁培养的表皮干细胞消化后制成细胞悬液，细胞密度为1 X IO6 2X IO6个/ml，表面种植浓缩为0. 2 0. 5ml细胞悬液，滴加在修饰几丁质膜表面，静置30min Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培养液，于 37°C,5% CO2培养箱中，常规培养1 2w，隔天换液，获得表皮干细胞-修饰几丁质膜仿生皮肤覆盖物。本专利技术可采取如下进一步措施所述步骤b-Ι)中，平衡液的pH为6. 9 7.2 ;1 型胶原可以采用从大鼠鼠尾、猪筋腱、牛筋腱提取的I型胶原；混合后I型胶原的终浓度为 0. 25 0. 5mg/ml。所述步骤b_2)中，采用Co60 5Kgy辐照，连续4 5次交联并灭菌。本专利技术以几丁质膜作为支架材料，经胶原混合液对其进行表面亲水性改性，并获得图案化表面修饰，材料孔径较小、网格均勻。与表皮干细胞共培养，细胞贴附量大且密，并且能够有效调控表皮干细胞的定向分化，从而激发和诱导组织的自身修复、再生能力，实现病损组织的形态和结构再生、功能重建。附图说明下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步的详细描述图1是本专利技术实施例分离ESCs形态与细胞集落显微镜观察结果；图2免疫细胞化学检测表皮干细胞的表面标志CK5、CK19、p63 ；图3是流式细胞仪检测ESCs表面标志结果⑶四、CD49d、CD71、CD34 ；图4是几丁质膜修饰前后激光共聚焦显微镜观察结果；图5是修饰几丁质膜上细胞集落肉眼观察情况；图6是几丁质膜其修饰前后用DiI染色和GFP标记细胞检测贴附效果的观察结果；图7是扫描电镜观察下修饰几丁质膜上的孔径及细胞生长情况；图8是几丁质膜空白材料在大鼠全厚层缺损动物模型上的体内降解试验结果；图9是几丁质膜以及ESCs-修饰几丁质膜在裸鼠全层皮肤缺损模型的创面愈合外观对照；图10是几丁质膜以及ESCs-修饰几丁质膜修复创面的表皮巢形成对照；图11是免疫组织化学检测体内早期表皮干细胞标志⑶34、⑶200表达变化；图12是免疫组织化学检测体内早期表皮巢毛囊干细胞主要部位标志⑶34、 CD200 ；图13是体内实验表皮干细胞早期标志的蛋白水平0^9、p63、VEGF、DSg3 ；图14是体内实验短暂增殖细胞(TAC)标志的蛋白水平CK5、CK10、CK14、CK15 ；图 15 是定量 PCR 检测 CD29、p63、VEGF、CK15mRNA 水平及调控因子 micro-203mRNA 水平。具体实施例方式图1 图15所示为本专利技术一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法的实施例，对几丁质膜进行表面修饰改性后获得具有较好相容性的生物材料， 通过体外与表皮干细胞共同培养，构建成类生物仿生皮肤覆盖物并进行鉴定检测；然后以此为暂时性敷料进行体内实验，在裸鼠全层皮肤缺损动物模型上进行原位诱导组织再生， 并定期取材进行各项指标检测。具体方法如下主要材料来源Defined keratindly SFM培养液(Gibco，10785，美国)；IV型胶原(Sigma，美国)； 小鼠抗大鼠β 1整合素(⑶29)单克隆抗体、小鼠抗大鼠角蛋白CK5、CK10、CK14、CK15、 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种表皮干细胞－修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，包括以下步骤：ａ）表皮干细胞的分离和培养取大鼠或小儿包皮全层皮肤，中性蛋白酶消化过夜，从表皮基底层提取单细胞，洗涤后加入ＤＫ－ＳＦＭ培养液，移至用Ⅳ型胶原预包被的培养瓶内，３７℃下静置１０～１５ｍｉｎ，贴壁细胞即为表皮干细胞；弃去未贴壁的细胞悬液，加入ＤＫ－ＳＦＭ培养液常规培养，取第２－３代细胞用于实验；ｂ）采用胶原混合液表面修饰几丁质膜ｂ－１）胶原混合液的制备在冰上进行如下操作：将无菌１０×ＰＢＳ、无菌蒸馏水、无菌新鲜１ＮＮａＯＨ混合配制平衡液，然后将Ｉ型胶原加入所述平衡液混合均匀；其中按照体积比５ｍｇ／ｍｌ　Ｉ型胶原∶１０×ＰＢＳ∶１Ｎ　ＮａＯＨ＝０．５～１．５∶０．２５～０．７５∶０．０５～０．１５，无菌蒸馏水补足总量，混合后Ｉ型胶原的终浓度为０．２５～３ｍｇ／ｍｌ；放置１５ｍｉｎ获得胶原混合液；ｂ－２）修饰几丁质膜根据模具，几丁质膜裁成呈正方形、且双层十字型放置，在其上加入所述胶原混合液，胶原混合液的添加量为０．２～０．４ｍｌ／ｃｍ２几丁质膜面积，冰上放置３０ｍｉｎ～１ｈ，然后放置在３７℃孵育箱４５ｍｉｎ～１ｈ，促进胶体形成；之后在温度－７０～－８０℃下预冷２０ｈ或过夜，－３０～－４０℃冷冻真空干燥２０～２５ｈ；Ｃｏ６０　５～１０Ｋｇｙ辐照，连续３～５次交联并灭菌而获得修饰几丁质膜；ｃ）表皮干细胞－修饰几丁质膜共培养修饰几丁质膜使用时用培养液平衡后待用；贴壁培养的表皮干细胞消化后制成细胞悬液，细胞密度为１×１０６～２×１０６个／ｍｌ，表面种植浓缩为０．２～０．５ｍｌ细胞悬液，滴加在修饰几丁质膜表面，静置３０ｍｉｎ～１ｈ后，加入含５～１０％胎牛血清的ＤＫ－ＳＦＭ培养液，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中，常规培养１～２ｗ，隔天换液，获得表皮干细胞－修饰几丁质膜仿生皮肤覆盖物。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈雁，戴丽冰，李孝建，梁蓉，
申请(专利权)人：沈雁，戴丽冰，李孝建，梁蓉，
类型：发明
国别省市：81