抗人Legumain蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株LGMN-2及其用途制造技术

本发明专利技术公开了抗人Legumain蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株LGMN‑2及其用途。本发明专利技术所提供的杂交瘤细胞株，名称为LGMN‑2，保藏号为CGMCC NO.12995。本发明专利技术所提供的抗人Legumain蛋白的单克隆抗体，由名称为LGMN‑2，保藏号为CGMCC NO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明专利技术的单克隆抗体具有较高的效价，间接法效价最高达1:2.56×10

【技术实现步骤摘要】
抗人Legumain蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株LGMN-2及其用途
本专利技术涉及生物医药工程
，尤其涉及抗人Legumain蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株LGMN-2及其用途。
技术介绍
Legumain(C13)(EC3.4.22.34)又称天冬酰胺内肽酶(asparaginylendopep-tidase，AEP)，是一种溶酶半胱氨酸蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶C13家族一个新成员。人的Legumain基因定位于14号染色体，编码由433个氨基酸残基组成的多肽链，去糖基化后成为具有生物活性的成熟酶，与小鼠具有83％的同源性。人的legumain蛋白具有3种形式，分别为56kD的酶原前体，46kD和36kD成熟酶。Legumain的活性催化中心是由组氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)组成的催化二联体，是Legumain发挥催化活性所必需的，也是每一个C13家族成员必有的结构。与正常组织相比，Legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs)中，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。Liu等最先报道Legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过Westernblot和免疫组化分析，发现在多种鼠肿瘤细胞中，Legumain表达增高，而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。Liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织，结果显示在正常组织中，Legumain表达极低，而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)Legumain高表达。侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式，也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。Legumain与整合素形成复合物，在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中，具有激活肿瘤细胞Pro-MMP2和Pro-CathepsinL的功能，促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实Legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。Murthy等通过Westernblot和免疫组织化学方法，对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测，结果表明，在原发性结肠癌中，Legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(P<0.05)，但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(P>0.05)。同时，Legumain在肿瘤患者瘤体(P＝0.01)或基质中的表达(P＝0.04)水平较低时，其预后较好。利用这种相关性，可将Legumain作为疾病诊断和预后判断的指标之一。Legumain作为一种新的生物学指标，目前临床上暂时没有针对其的检测方法，在监测肿瘤的发生发展中的应用还属空白。
技术实现思路
基于上述领域的空白，本专利技术提供了一种用于检测Legumain蛋白的试剂盒。本专利技术所提供的用于检测Legumain蛋白的试剂盒，包括由如下单克隆抗体A和单克隆抗体B的组成的单克隆抗体对：单克隆抗体A：由名称为LGMN-1，保藏号为CGMCCNO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生；单克隆抗体B：由名称为LGMN-2，保藏号为CGMCCNO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。本专利技术还提供了一种杂交瘤细胞株，名称为LGMN-1，保藏号为CGMCCNO.12994。本专利技术所提供的杂交瘤细胞株LGMN-1CGMCCNO.12994于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。一种抗人Legumain蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤细胞株LGMN-1分泌产生。本专利技术还提供了一种杂交瘤细胞株，名称为LGMN-2，保藏号为CGMCCNO.12995。本专利技术所提供的杂交瘤细胞株LGMN-2CGMCCNO.12995于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。一种抗人Legumain蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤细胞株LGMN-2分泌产生。所述单克隆抗体在作为抗原抗体反应中识别人Legumain蛋白的抗体用途也属于本专利技术的保护范围。本专利技术首先利用分子克隆的方法构建了人Legumain真核表达质粒pCDNA3.1-tpa-hLGMN，利用瞬时转染的方法转染HEK293T细胞，采用亲和层析和离子交换层析对蛋白进行纯化，从细胞培养上清中纯化得到目的蛋白。本专利技术利用体外表达的人Legumain蛋白作为抗原，制备了两种人Legumain单克隆抗体，这两种单克隆抗体分别由编号为CGMCCNO.12994和CGMCCNO.12995的杂交瘤细胞株所分泌。具体而言，本专利技术采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备人Legumain的单克隆抗体，通过以下技术实现：通过将免疫人Legumain抗原的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌抗人Legumain单克隆抗体的杂交瘤细胞，接种小鼠腹腔，制备含有抗人Legumain抗体的腹水，经过后期处理并验证，得到特异性好、抗体水平高且能长期保存的抗人Legumain单克隆抗体。对本专利技术的单克隆抗体，经生物标记或化学标记后获得的标记单克隆抗体也在本专利的保护范围。进一步地，经酶标记的上述单克隆抗体属于本专利的保护范围。所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。本专利技术提供的抗人Legumain单克隆抗体有如下特点和优点：(1)本专利技术的单克隆抗体具有较高的效价，间接法效价最高达1∶2.56×108。(2)本专利技术的单克隆抗体与Legumain同家族蛋白CathepsinB，CathepsinH和CathepsinL无交叉反应，具有较好的特异性。(3)本专利技术杂交瘤细胞LGMN-1和LGMN-2分泌的单克隆抗体亲和常数分别为1.48×107和1.32×107，可广泛应用于人Legumain抗原的检测，鉴别，筛查，癌症诊断以及预后评价中。附图说明图1为重组质粒pCDNA3.1-tpa-LGMN的酶切鉴定结果图；其中1为tpa-hLGMNPCR片段，2为pcDNA3.1-tpa-hLGMN双酶切，M为DNA分子量标准MarkerDL2000(Takara,CatNo.3427A)。图2为重组人Legumain纯化抗原的SDS-PAGE图；其中，P1为亲和层析纯化得到的Legumain(pH8.0)，MW为蛋白分子量标准。图3为Westernblot检测重组人Legumain的免疫原性图；其中P1为人Legumain，MW为蛋白分量标准。图4为杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的免疫印迹图；其中P1为单克隆抗体LGMN-A，P2为单克隆抗体LGMN-B，MW为蛋白分子量标准，C为阳性对照。具体实施方式实施例1、制备抗人Legumain蛋白的单克隆抗体一、Legumain抗原制备1)Legumain基因序列的获得Legumain编码基因位于人的第14号染色体上(14q32.12)，在NCBI数据库中的序列号为CCDS:CCDS9904.1。携带人Legumain基因的质粒pLEX本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，名称为LGMN‑2，保藏号为CGMCC NO.12995。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，名称为LGMN-2，保藏号为CGMCCNO.12995。2.一种抗人Legumain蛋白的单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，
申请(专利权)人：李伟，南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11