一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法技术

本发明专利技术提出一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，包括将包含重编程因子的重编程载体转入皮肤成纤维细胞中，以及将含有重编程载体的皮肤成纤维细胞在人胚胎干细胞诱导培养基中诱导培养，其中，人胚胎干细胞诱导培养基中含有小分子化合物。本发明专利技术选择Oct4、Sox2、Lin28、Nanog作为重编程因子，Brd U、PD0325901、Thiazovivin、Y‑27632作为小分子化合物，能够提高皮肤成纤维细胞的重编程效率并降低所获iPSC的致瘤性。

A Method of Inducing Reprogramming of Skin Fibroblasts

The invention provides a method for inducing the reprogramming of skin fibroblasts, including transferring the reprogramming vector containing the reprogramming factor into the skin fibroblasts and inducing the culture of the skin fibroblasts containing the reprogramming vector in the human embryonic stem cell induction medium, in which the human embryonic stem cell induction medium contains small molecule compounds. Oct4, Sox2, Lin28 and Nanog are selected as reprogramming factors, Brd U, PD0325901, Thiazovivin and Y 27632 are selected as small molecular compounds, which can improve the reprogramming efficiency of skin fibroblasts and reduce the tumorigenicity of the obtained iPSC.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法。
技术介绍
胚胎干细胞具有自我更新能力和分化多能性两大特点，使得在体外获得各种不同的细胞、组织甚至器官成为可能。但是人胚胎干细胞来源于人的胚胎，存在伦理问题；另外，自其他个体胚胎干细胞在真正应用时，免疫排斥问题也无法解决，因此胚胎干细胞在实际临床应用中受到很大限制。而将体细胞重编程得到的诱导性多能干细胞(iPSC)可以有效避免胚胎干细胞在应用过程中存在的伦理问题和免疫排斥问题。但是，iPSC技术一直存在体细胞重编程效率低的问题，使iPSC不能展开大规模的研究和应用。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，通过选择合适的重编程因子和小分子化合物，能够提高皮肤成纤维细胞的重编程效率并降低所获iPSC的致瘤性。本专利技术提出一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，包括以下步骤：将重编程载体转入皮肤成纤维细胞中，其中，重编程载体包含重编程因子；然后将含有重编程载体的皮肤成纤维细胞在人胚胎干细胞诱导培养基中诱导培养，其中，人胚胎干细胞诱导培养基中含有小分子化合物。优选地，所述重编程因子为：Oct4，Sox2，Lin28，Nanog。优选地，所述小分子化合物为：BrdU、PD0325901、Thiazovivin、Y-27632。优选地，所述小分子化合物的工作浓度为：BrdU的工作浓度为15μM/L；PD0325901的工作浓度为1μM/L；Thiazovivin的工作浓度为0.5μM/L；Y-27632的工作浓度为5μM/L。优选地，所述重编程载体通过电转诱导或慢病毒诱导的方式转入皮肤成纤维细胞中。本专利技术还提出的一种所述诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法得到的人诱导性多能干细胞。本专利技术提出的一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，选用Oct4，Sox2，Lin28，Nanog作为重编程因子，在诱导培养基中添加小分子化合物BrdU、PD0325901、Thiazovivin、Y-27632。在不使用具有潜在致瘤性(例如c-MYC或KLF4)的重编程因子的情况下，使皮肤成纤维细胞具有较高的重编程效率，减少了iPSC致瘤的风险。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明，实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。实施例11.1将皮肤组织放入培养皿中，用含双抗(青霉素500U/ml，链霉素500μg/ml)(GIBCO)的PBS灭菌溶液漂洗至少3次，然后用灭菌后的眼科剪和手术刀处理皮肤组织，使白色皮下脂肪去除，表皮略去除，分离表皮及皮下组织，留下真皮层，得到预处理的皮肤组织。1.2在10cm细胞培养皿中加入1.5ml含有20％(v/v)FBS(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)，将预处理的皮肤组织转移到培养基中，将预处理的皮肤组织切成小块，得到边缘整齐的皮肤组织块。1.3取出包被了0.1％明胶(Millipore)的六孔板，吸出明胶溶液，PBS洗一次后在生物安全柜内晾干，然后将皮肤组织块置于六孔板中，将表皮面向上，皮肤组织块间隔一定距离，不加培养液将六孔板置于37℃细胞培养箱中20～40min。1.4取出六孔板至生物安全柜，向每个孔内加入含有10％(v/v)FBS(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)至没过皮肤组织块，加入培养基时避免将皮肤组织块吹起，然后将六孔板置于37℃细胞培养箱中培养。1.5显微镜下观察到有成纤维细胞爬出时即可换液，同时将组织块弃去，将培养基的量增加至2～3ml，每隔1-3天更换培养基。每次换液前先用2m1PBS漂洗细胞表面2次。1.6待成纤维细胞在每个培养孔中汇合到孔的边缘时，吸弃原培养液，PBS洗2遍，加入500μl0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，细胞培养箱内放置约4～6min，待细胞变圆脱落、漂浮时，立即加入培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15ml离心管，200g离心5min，吸弃上清液，加入细胞培养基混匀，转移至用Matrigel(BD)包被的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养。1.7将第1-3代皮肤成纤维细胞用PBS洗两遍后，500μl0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)消化至细胞分散，加入FBS(GIBCO)终止消化，200g离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞，血球计数板计数。1.8取约5×105皮肤成纤维细胞，200g离心5min，弃上清，按HumanDermalKit试剂盒说明书，加入相应试剂，重悬细胞，在细胞悬液中加入含有重编程因子Oct4，Sox2，Lin28，Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，电转仪选择U-013程序，开始电转。1.9电转结束后，取出电转杯，迅速加入少量REGM培养基(LONZA)，将细胞悬液吸出加入铺好Matrigel(BD)的平板内，加入2～3mlREGM培养基(LONZA)，37℃细胞培养箱静置培养。1.10待细胞贴附后观察，待细胞密度达到70～80％，吸去REGM培养基，PBS洗2遍后加入人胚胎干细胞诱导培养基进行诱导培养8天，其中人胚胎干细胞诱导培养基为含有小分子化合物的人胚胎干细胞培养基mTeSR1(StemCellTechnologies)，小分子化合物的工作浓度如下：BrdU(Sigma)为15μM/L、PD0325901(Selleck)为1μM/L、Thiazovivin(Selleck)为0.5μM/L、Y-27632(Sigma)为5μM/L；第9天更换为人胚胎干细胞培养基mTeSR1，每日换液至出现人胚胎干细胞状克隆。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重编程载体转入皮肤成纤维细胞中，其中，重编程载体包含重编程因子；然后将含有重编程载体的皮肤成纤维细胞在人胚胎干细胞诱导培养基中诱导培养，其中，人胚胎干细胞诱导培养基中含有小分子化合物。

【技术特征摘要】
1.一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重编程载体转入皮肤成纤维细胞中，其中，重编程载体包含重编程因子；然后将含有重编程载体的皮肤成纤维细胞在人胚胎干细胞诱导培养基中诱导培养，其中，人胚胎干细胞诱导培养基中含有小分子化合物。2.根据权利要求1所述诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述重编程因子为：Oct4，Sox2，Lin28，Nanog。3.根据权利要求1所述诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述小分子化合物为：BrdU、PD0325901、Thiazo...

【专利技术属性】
技术研发人员：王真，
申请(专利权)人：合肥中科干细胞再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34