一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。所述构建方法包括：将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。本发明专利技术发现针对小鼠Ano5基因第360位设计打靶载体进行突变，得到的颌骨或骨干发育不良小鼠模型病理改变明显，且呈现和患者临床表现相似的骨骼病变特征，利用此构建方法得到的小鼠模型可以为揭示颌骨或骨干发育不良疾病的分子机制提供有效安全的实验工具。

【技术实现步骤摘要】
一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。
技术介绍
颌骨或骨干发育不良(GnathodiaphysiaDysplasia，GDD)是一种罕见的常染色体显性遗传病，病变主要累及口腔和长骨。临床表现为颌面部畸形、下颌骨牙骨质/骨发育不良和颌骨骨髓炎等；管状骨侧弯、骨皮质增厚和骨脆性增加等。患者在青少年时期可多次发生无诱因骨折，血中碱性磷酸酶水平增高，牙龈溢脓和拔牙后不易愈合。该病给患者及其家人造成极大的精神痛苦和沉重的经济负担，目前针对GDD仅限于手术和姑息治疗，无特异性的药物干预措施。因此探究GDD发生的分子机制，对于指导其临床治疗具有重要的意义。ANO5(Anoctamin5/TMEM16E)是GDD的致病基因，其编码蛋白是ANO家族成员之一。ANO5蛋白具有8个跨膜结构域，以同源二聚体的形式构成通道，可能发挥钙离子激活的Cl-通道(Calcium-activatedchloridechannels,CaCCs)或磷脂爬行酶(Phospholipidscramblase，PLSCR)的功能。ANO5在成年小鼠的颅盖骨、股骨和下颌骨中高度表达，其杂合突变与GDD的发生密切相关。迄今为止，报道显示至少有10个ANO5基因突变可导致GDD。体外研究发现，Cys356Arg和Cys356Gly突变可以导致ANO5蛋白不稳定，更易于被蛋白酶体降解；Thr513Ile突变可使细胞发生磷酯酰丝氨酸外翻，从而导致骨骼发生病理性矿化。利用动物模型对GDD的发病机制进行研究也逐渐被重视。几个针对Ano5的不同外显子区域的基因敲除小鼠或者兔子动物模型，主要表现为：①骨骼肌病变表型，如成肌细胞膜融合和修复障碍；②精子活动度减低；③部分GDD骨病变特征。Rolvien等首次利用CRISPR/Cas9方法建立Ano5基因T491F突变(人类p.Ser500Phe)小鼠模型，对12和24周龄小鼠进行了影像学和组织学表型鉴定，仅有纯合突变小鼠表现轻微肌肉质量增加的改变，却未表现任何骨骼相关的病理特征。到目前为止，多数关于ANO5基因突变的研究，均只限于体外实验，无法在动物体内模拟发病现场，不能真实再现疾病发生的分子事件。建立动物模型是研究ANO5基因突变导致GDD的更佳途径。只有一篇文献报道Ano5基因T491F突变小鼠模型，该突变相当于人类p.Ser500Phe突变，首次是由德国学者Rolvien团队报道，患者是一位中国裔13岁男孩，其临床表现为股骨骨折频发，牙齿萌出障碍，颌骨恶性肿瘤样改变。但是该突变模型并未重复出GDD患者相关的骨骼病理性改变。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。本专利技术通过突变小鼠基因组中特定位点，得到一种Ano5基因突变小鼠，其呈现与患者临床表现相似的骨骼病变特征，适用于颌骨或骨干发育不良疾病的分子机制的研究。第一方面，本专利技术提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型构建方法，包括：将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。进一步地，基于CRISPR/Cas9方法，通过打靶载体将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。进一步地，所述打靶载体包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。进一步地，所述构建方法包括：构建打靶载体，并转染ES细胞；将sgRNA和Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，和打靶载体阳性的ES细胞一起置于小鼠囊胚中。进一步地，所述sgRNA包括如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。进一步地，所述小鼠为野生型小鼠。第二方面，本专利技术提供一种打靶载体，所述打靶载体包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术进一步提供包括所述打靶载体的试剂盒。本专利技术进一步提供所述打靶载体或所述试剂盒在构建颌骨或骨干发育不良小鼠模型中的应用。第三方面，本专利技术提供一种sgRNA，所述sgRNA包括如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。本专利技术进一步提供包含所述sgRNA的生物材料。本专利技术进一步提供所述sgRNA或所述生物材料在构建颌骨或骨干发育不良小鼠模型中的应用。本专利技术进一步提供一种用于鉴定上述构建方法构建得到的颌骨或骨干发育不良小鼠模型的引物对，所述引物对包括：Ano5-F1：5’-GCTTAGGTCTTCTACATCGGGCTCT-3’(SEQIDNO:4)Ano5-R1：5’-ATCCCCATGAAGAGCGCAAAGAACA-3’(SEQIDNO:5)。本专利技术具备如下有益效果：本专利技术利用Cas9/sgRNA和携带有C360Y突变位点的打靶载体，将野生型小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸，由此制备出与GDD相关的突变小鼠模型。此模型经过测序证实已经携带中国GDD患者的基因突变位点C360Y，并且通过影像学、血清学和组织学等方面检测呈现与患者临床表现相似的骨骼病变特征。这表明了，利用此模式动物可以为揭示GDD疾病的分子机制提供有效安全的实验工具。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的构建示意图；其中A为sgRNA设计示意图；B为打靶载体示意图；C为突变位点的测序结果。图2为本专利技术实施例2提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的表型检测结果。图3为本专利技术实施例2提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的血清学检测结果。图4为本专利技术实施例2提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的骨组织形态学检测结果。图5为本专利技术实施例2提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的胫骨力学性能检测结果。图6为本专利技术实施例2提供的Ano5基因C360Y突变小鼠模型的破骨细胞分化和功能检测结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1Ano5基因C360Y突变小鼠模型的构建设计并筛查Cas9/sgRNA。根据小鼠Ano5基因(GenBank：NC_000073.6)第11和12外显子序列，基于CRISPR-Cas9系统在突变位点的两侧内含子上设计sgRNA(图1中的A)。所述Ano5的sgRNA序列如下：第11外显子上的识别位点：5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′第12外显子上的识别位点：5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′构建打靶载体EGE-LSQ-001。打靶载体示意图如图1中的B所示，其中用于重组突变目标位点(Ano5基因第360位)的序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。经过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。将打靶载体电转至ES细胞，通过正负筛选获得阳性ES克隆，并采用PCR和southe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：/n将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：
将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括：基于CRISPR/Cas9方法，通过打靶载体将小鼠基因组中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述打靶载体包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括：
构建所述打靶载体，并转染ES细胞；
将sgRNA和Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，和打靶载体阳性的ES细胞一起置于小鼠囊胚中。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括如SEQIDNO:2和...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡颖，李鸿宇，王小予，董蕊，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京口腔医院，
类型：发明
国别省市：北京;11