一种复制缺陷型乙脑病毒的制备方法和相关应用技术

本发明专利技术公开了一种复制缺陷型乙脑病毒的制备方法和相关应用，制备该复制缺陷型病毒的方法包括以下步骤：a）构建稳定表达日本脑炎病毒（JEV，Japanese encephalitis virus）C蛋白的细胞系；b）构建C蛋白编码基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体；c）C蛋白基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体，转入稳定表达C蛋白的细胞系中,缺失C蛋白基因的JEV复制子和细胞中的C蛋白形成互补，组成外形完整的病毒颗粒，并把RNA包装进入病毒颗粒；d）培养细胞，收集细胞培养上清中的复制缺陷病毒，作为诊断试剂或者疫苗。上述制备方法简单有效，适合大规模生产，制备的复制缺陷病毒有多种应用，包括：a）作为病毒抗体诊断的抗原；b）单独或者加入佐剂，作为疫苗使用。

【技术实现步骤摘要】
一种复制缺陷型乙脑病毒的制备方法和相关应用
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种复制缺陷型乙脑病毒的制备方法和相关应用，制备的病毒颗粒可以用作疫苗或者诊断试剂抗原。技术背景乙脑病毒是乙型脑炎的病原体，最初于1953年从日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV）。在我国，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。JEV是一种经蚊虫传播的人畜共患的传染病原，可以在贮存宿主中长期存活，并在扩增宿主中繁殖，通过蚊虫叮咬感染人或动物，引起人类或动物的病毒性脑炎或繁殖障碍，甚至死亡。对人类社会卫生安全以及养殖业安全生产都带来严重的威胁。自然界或养殖业中大多数动物都是JEV的易感动物，其中猪是重要的贮存和扩增宿主，也是主要的越冬宿主。猪在自然感染后长期的、高滴度的病毒血症是JEV传播给人或其他动物的主要传染源；鸟类也是JEV重要的贮存宿主，其中候鸟被认为是JEV长距离传播的主要传染源。JEV病毒粒子呈球形，直径约为50nm，是二十面体对称结构。病毒的基因组全长约有1lKb，为一单股正义RNA，由5’端非编码区(Untranslatedregion，UTR)、单一开放阅读框(Openreadingframe，ORF)和3’端非编码区构成。ORF编码一个多聚蛋白前体，经宿主、病毒蛋白酶切割、加工，可产生三个结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白prM／M、囊膜蛋白E)、7个非结构蛋白(NSI，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)以及两个多肽切割片段(Pr和Anch片段)。病毒粒子病毒外有囊膜，膜上有E蛋白，并镶嵌有M蛋白；内有C蛋白包裹着一条正链病毒RNA形成核心，C蛋白主要起到保护核酸的作用。三个结构蛋白中，E是主要的免疫原蛋白。JEV主要以蚊虫为传播媒介，猪等家畜又是其主要的贮存和扩增宿主，因此很难被彻底消灭。目前对JEV还没有的特效药物和治疗方法，因此疫苗接种仍然是控制日本脑炎流行、预防JEV感染的唯一有效策略。在过去的半个多世纪里，多种类型的日本脑炎病毒疫苗，主要可分为灭活疫苗和减毒活疫苗两大类。早期灭活疫苗为组织培养（鼠脑或者地鼠肾），杂质多，副反应大，新一代灭活疫苗还是有以下缺陷：1）灭活可能会破坏抗原完整性，造成免疫原的丢失；2）灭活疫苗主要以激活体液免疫为主，激活细胞免疫效果差；3）灭活苗中通常加入佐剂，易引起应激反应。我国广泛使用的减毒活疫苗，免疫原保存完整，激活细胞免疫和体液免疫效果好，但是生产和使用中有弱毒返强的安全风险。目前，新一代疫苗的开发，包括亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗等成为这个领域的热点。AsatoKojima等报道了稳定表达结构蛋白prM和E的疫苗制备方法，该方法制备的是由两种结构蛋白组装而成的病毒样颗粒（virus-likeparticle,VLP）,这种VLP具有较好的免疫原性，但是这种空心的囊膜结构，内部没有C蛋白和RNA，稳定性差，长期保存有问题（AsatoK,AtsushiY,HidekiA,etal.Stablehigh-producercellcloneexpressingvirus-likeparticlesoftheJapaneseencephalitisviruseproteinforasecond-generationsubunitvaccine.JournalofVirology,2003,77(16):8745.）。为更好保持抗原完整性，研究人员把结构蛋白prM和E基因放到各种病毒或者DNA\RNA载体上，制备载体疫苗或者核酸疫苗（IshikawaT,WidmanDG,BourneN,etal.ConstructionandevaluationofachimericpseudoinfectiousvirusvaccinetopreventJapaneseencephalitis.Vaccine,2008,26(22):0-2781），病毒载体疫苗有潜在的安全风险,核酸易降解，不利于长期保存。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题就是制备一种安全、完整而且便于方法生产的病毒颗粒，即复制缺陷型JEV。具体来说，专利技术人采用反向遗传学的方法改造JEV的基因组，构建一个复制缺陷的JEV，该病毒不能在普通细胞中复制，但是可以在专门构建的互补细胞中复制，产生更多的复制缺陷病毒。采用这种高效的复制缺陷型病毒的制备方法，所制备的JEV病毒颗粒：1）只能感染一次细胞，不能在细胞间扩散，有很高的安全性；2）保持了完整的免疫原性，既能激活体液免疫，又能激活细胞免疫；3）容易放大生产；4）病毒颗粒稳定，便于长期保存。本专利技术提供了一种复制缺陷型乙脑病毒（replication-defectiveJEV）的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a）构建稳定表达日本脑炎病毒（JEV，Japaneseencephalitisvirus）C蛋白的细胞系；b）构建C蛋白编码基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体；c）C蛋白基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体，转入稳定表达C蛋白的细胞系中,缺失C蛋白基因的JEV复制子和细胞中的C蛋白形成互补，组成外形完整病毒颗粒，并把RNA包装进入病毒颗粒；d）培养细胞，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，作为诊断试剂或者疫苗。本专利技术中，如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a）所述的JEV的C蛋白基因，放入哺乳动物表达载体，该表达载体含有药物抗性基因，是指可以在哺乳细胞中完成目的蛋白表达的载体，包括但不限于pCAGGS、pCI、pcDNA、plenti6.3等；步骤a）所述的细胞为哺乳动物细胞系，包括贴壁和悬浮细胞，优选但不限于生物制药领域常用CHO、293T、293F、BHK、Vero、MDCK，优选BHK-S细胞；步骤a）所述的稳定细胞，通过把JEV的C蛋白表达载体转入细胞中，然后用药物筛选能表达C蛋白的阳性细胞。本专利技术中，步骤b）所述的JEV病毒复制子DNA载体，可以通过反向遗传学得到，该载体包含转录启动子和C蛋白缺失的病毒复制子，缺失C蛋白15-110肽段部分、或者中间任何部分、或者功能性突变，优选缺失26-105肽段编码序列。本专利技术中，步骤c）所述的DNA载体转入细胞，可以选择转染或者电转化；DNA载体进入细胞后，在启动子引导下转录下游的病毒RNA，该RNA含有缺失的C蛋白基因序列；转录出来的RNA可以翻译编码的病毒蛋白，但是由于C蛋白基因缺失无法翻译完整的C蛋白；细胞中稳定表达的C蛋白和复制子翻译的其他病毒蛋白互补，合并转录出来的RNA，共同包装形成完成的病毒颗粒；该病毒颗粒包装的RNA含有缺失的C蛋白编码序列，是复制缺陷型病毒颗粒。本专利技术中，步骤d）所述的培养细胞过程，复制缺陷型病毒进入其他互补细胞中，反复“进细胞-包装-出细胞”循环，制备更多的复制缺陷型病毒。本专利技术中，分别构建的缺陷型病毒基因组和稳定细胞系，形成互补，制备复制缺陷型的JEV（见附图一），所述的方法简单高效，制备的病毒样颗粒可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制缺陷型乙脑病毒（replication-defective JEV）的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/na）构建稳定表达日本脑炎病毒（JEV，Japanese encephalitis virus）C蛋白的细胞系；/nb）构建C蛋白编码基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体；/nc）C蛋白基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体，转入稳定表达C蛋白的细胞系中,缺失C蛋白基因的JEV复制子和细胞中的C蛋白形成互补，组成外形完整病毒颗粒，并把RNA包装进入病毒颗粒；/nd）培养细胞，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，作为诊断试剂或者疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种复制缺陷型乙脑病毒（replication-defectiveJEV）的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）构建稳定表达日本脑炎病毒（JEV，Japaneseencephalitisvirus）C蛋白的细胞系；
b）构建C蛋白编码基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体；
c）C蛋白基因缺失的JEV病毒复制子DNA载体，转入稳定表达C蛋白的细胞系中,缺失C蛋白基因的JEV复制子和细胞中的C蛋白形成互补，组成外形完整病毒颗粒，并把RNA包装进入病毒颗粒；
d）培养细胞，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，作为诊断试剂或者疫苗。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a）所述的JEV的C蛋白基因，放入哺乳动物表达载体，该表达载体含有药物抗性基因，是指可以在真核细胞中完成目的蛋白表达的载体，包括但不限于pCAGGS、pCI、pcDNA、plenti6.3等；步骤a）所述的细胞为哺乳动物细胞系，包括贴壁和悬浮细胞，优选但不限于生物制药领域常用CHO、293T、293F、BHK、Vero、MDCK，优选BHK-S细胞；步骤a）所述的稳定细胞，通过把JEV的C蛋白表达载体转入细胞中，然后用药物筛选能表达C蛋白的阳性细胞。


3.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琦，
申请(专利权)人：王宁，
类型：发明
国别省市：上海;31