一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种针对小鼠Ncr1基因的gRNA，利用所述gRNA，进一步将包含重组左臂、核糖体接入位点（IRES）、白喉毒素受体（DTR）和绿色荧光蛋白（EGFP）融合编码序列、重组右臂的同源重组载体同源重组到小鼠Ncr1基因，构建了一个Ncr1

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞（natural killer cell）是一种细胞质中具有大颗粒的细胞，简称NK细胞（NK cell），也称作大颗粒淋巴细胞（LGL, Large Granular Lymphocytes）。由骨髓淋巴样干细胞发育而成，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。自然杀伤细胞可通过直接和陌生细胞接触，分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，以细胞膜破裂的方式杀死目标细胞。因为其非专一性的细胞毒杀作用而被命名。
[0003]NK细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。在抗肿瘤研究中，NK细胞扮演关键角色，NK细胞有两方面抗癌作用，一是上述的对肿瘤细胞的直接杀伤，通过释放后穿孔素和颗粒酶或通过死亡受体杀死肿瘤细胞；二是它通过分泌细胞因子和趋化因子扮演免疫系统的调节细胞角色，激活T细胞等的杀伤作用。目前用于肿瘤免疫治疗的NK细胞策略有：体外活化的自体或异体NK细胞治疗；联合NK细胞和单抗药（如免疫检查点抑制剂）来诱导抗体特异的细胞毒性；构建CAR
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NK细胞免疫疗法等。
[0004]在体内特异性的剔除某一类细胞，是研究该类细胞在体内功能的一种有效方法。为了更好的研究NK细胞的作用和功能，研究人员开发了多种NK细胞缺陷小鼠模型，如Beige小鼠、NSG小鼠、Perforin基因缺失小鼠等。Beige小鼠是最早发现的NK细胞功能缺陷小鼠模型之一，缺陷原因是因为小鼠自发点突变，造成其在天然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性中均缺乏NK细胞裂解细胞的功能；NSG小鼠是一种T,B,NK细胞均缺失的小鼠重度免疫缺陷小鼠类型，该模型因为Il2rg基因缺陷导致NK细胞缺失；Perforin基因敲除小鼠模型的NK细胞，对MHC
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I分子缺失细胞的杀伤能力显著下降。这些NK细胞缺陷模型无论是NK细胞杀伤能力的缺陷，还是NK细胞数量的减少，都广泛应用于NK细胞发育、驯化机制研究和NK细胞生物医药研发，但这些模型中NK细胞的缺陷是小鼠生来就有的免疫缺陷，这种长期的免疫缺陷可能导致机体本身适应性的代偿和小鼠本身其他免疫方面的异常，导致研究结果的误读。因此，迫切需求有一种可诱导性的NK细胞缺陷小鼠模型，其可以在诱导剂的作用下，在特定时间内造成NK细胞缺失，在其他时间段内，NK细胞维持正常状态，用于NK细胞的研究。
[0005]白喉毒素（DT）和其受体（DTR）介导的细胞毒性是一种非常高效的细胞杀伤系统。白喉毒素是人类发现的第一种细菌毒素，其通过受体进入细胞之后，由于其含有 ADP 依赖的核糖体转移酶活性，能催化 NAD+的 ADP 核糖基向延长因子（EF
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2）转移，生成烟酰胺，使EF
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2失活，从而阻断细胞蛋白质的合成，最后导致细胞死亡。真核细胞细胞质中单个分子的白喉毒素活性就足以杀死细胞，这种杀伤机制严格依赖于其受体
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肝素结合 EGF 样生长因子前体（proHB
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EGF，也称为 DTR）介导的内吞作用。人类和灵长类动物细胞天然对 DT 敏感，但鼠细胞对白喉毒素的杀伤不敏感。原因在于灵长类和人类的HB
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EGF分子作为白喉毒
素受体，可以和白喉毒素结合从而发挥细胞毒性作用，但是小鼠表达的HB
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EGF分子由于序列差异，不会和白喉毒素结合。因此，小鼠细胞对白喉毒素的抗性约是人类细胞的105倍。已有的研究表明，如果将灵长类动物的DTR转入小鼠细胞可使小鼠对DT产生敏感。因此，可以借助细胞类型特异的启动子驱动灵长类DTR在小鼠特定细胞类型表达，进而通过给予小鼠白喉毒素，实现对特定细胞类型的可诱导杀伤。
[0006]目前研究发现NK细胞表面有多种受体分子，如CD56、NCR1、NKp30等，其中NCR1目前被认为是有关NK细胞的最可靠的标志物。NCR1在多种物种（人类、小鼠、非人类灵长类动物）的所有NK细胞（CD49b+和CD49b
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）都有表达。2007年法国Eric Vivier课题组利用Ncr1启动子构建了Ncr1
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DTR转基因小鼠，在NK细胞中驱动DTR表达，实现对NK细胞的选择性杀伤（Thierry Walzer，et.al. Identification, activation, and selective in vivo ablation of mouse NK cells via NKp46. PNAS, February 27, 2007 104 (9) 3384
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3389）。转基因方法小鼠模型制备，本身具有插入位点不确定，表达细胞类型和表达量不确定等缺陷，后期需要进行大量的建系和品系鉴定工作，根据文献报道，Eric Vivier课题组从6个品系founder中筛选到一个相对符合要求的DTR品系。针对这些问题，本专利技术通过定点敲入的方式，将IRES
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DTRGFP表达元件定点插入到Ncr1基因位点，构建了Ncr1
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DTR小鼠模型，实现了在特定时间段内对NK细胞的杀伤。该模型利用Ncr1内源基因启动子驱动DTRGFP表达，因为插入位点确定、驱动表达的基因确定，不需要进行品系founder筛选，模型制备方法明确、高效。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种构建可诱导性NK细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用。该方法利用Ncr1分子是小鼠NK细胞特异性标记分子这一特性，通过将白喉毒素受体和绿色荧光蛋白定点插入到Ncr1分子基因表达框，构建了一个Ncr1
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IRES
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DTR
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EGFP（简称：Ncr1
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DTR）基因修饰小鼠模型，该模型可以实现小鼠内源Ncr1基因驱动白喉毒素受体和绿色荧光蛋白在NK细胞的表达。利用该模型，专利技术人可以通过EGFP荧光表达标记小鼠NK细胞；可以通过在特定时间点或时间段内给予小鼠白喉毒素将NK细胞杀死，造成NK细胞缺失，对NK细胞在特定生理、病理过程中的作用进行研究。
[0008]为实现本专利技术，采用了如下技术方案。
[0009]本专利技术公开了一种针对小鼠Ncr1基因的gRNA，所述gRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:1
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10所示。
[0010]优选的，所述gRNA的靶位点序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0011]本专利技术公开了一种用于构建可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒包括：（1）针对小鼠Ncr1基因的gRNA，所述gRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:1
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10所示；（2）包含白喉毒素受体编码本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对小鼠Ncr1基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:5所示。2.一种用于构建可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（1）针对小鼠Ncr1基因的gRNA，所述gRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:5所示；（2）包含白喉毒素受体编码序列的同源重组载体；（3）Cas9 mRNA。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括的同源重组载体为针对小鼠Ncr1基因的同源重组载体，所述载体从左到右顺序包括：重组左臂、核糖体接入位点序列、白喉毒素受体编码序列与绿色荧光蛋白编码序列融合序列元件、重组右臂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述重组左臂、核糖体接入位点序列、白喉毒素受体编码序列与绿色荧光蛋白编码序列融合序列元件、重组右臂的序列分别如SEQ ID NO:11
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14所示。5.根据权利要求2
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4任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述同源重组载体为PBR322。6.根据权利要求2
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4任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙瑞林，王津津，周宇，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司上海砥石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：