人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术构建的人源化CCR2基因改造动物模型能够加速与人CCR2基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如利用人源化CCR2基因改造动物模型代替人试药，为进行CCR2靶点药物的临床前实验提供有效的模型和有力的工具。优选的，本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将鼠源的Ccr2基因替换为人源的CCR2基因，构建能与抗人源CCR2抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，可用于筛选和评价针对人CCR2基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

【技术实现步骤摘要】
人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠(仓鼠)、兔、犬、猴、猪、鱼等。虽然人类绝大部分基因在动物中存在同源基因，但在基因序列和蛋白质序列上，人类和动物仍然存在不少差异，导致许多针对人类靶点的药物不能与动物体内的同源蛋白结合产生药效，这在大分子抗体药物中尤其显著，因为大分子抗体药物的特异性很高，一个氨基酸的差异都有可能导致抗体不识别靶分子，例如针对人类PD-1靶点的抗肿瘤药物Keytruda，就不能识别小鼠的Pd-1蛋白，导致无法用这些动物进行临床前药理药效、药物代谢以及药物毒性安全性评价。因此，大量的临床前研究急需更好的动物模型。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即利用基因修饰操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同源基因，可在动物体内建立更接近人类疾病特征的正常或突变基因的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可提高药物对体内药靶的识别性，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达人类功能的蛋白质，从而大大减少临床前动物实验与临床实验结果的差异，为在临床前动物体内水平进行药物筛选和验证提供了可能。CCR2属于G蛋白偶联受体，含有7个跨膜区，编码355个氨基酸残基蛋白，相对分子质量为41000。人类的CCR2基因定位于3p21，编码CCR2蛋白。CCR2在单核细胞中是组成性表达，而在T淋巴细胞中是诱导性表达。CCR2是CCL2的关键功能受体，也可以结合CCL7和CCL12。CCR2与CCL2结合，可以诱导单核/巨噬细胞趋化并激活，通过调节其它炎性介质的产生和释放形成级联反应，介导炎症反应。目前，使用CCR2抑制剂靶向乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的CCL2-CCR2轴是抑制肿瘤生长和转移的有效思路。而人源CCR2靶点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，但由于种属性的差异，人源CCR2与鼠源Ccr2蛋白的同源性只有68％，在小鼠上筛选的靶点药物并不完全适用于人类，同样针对人源CCR2蛋白的药物也不一定能够识别小鼠的Ccr2蛋白。因此，构建具有人源CCR2靶点的人源化小鼠模型，在筛选评价人源CCR2靶点药物中具有非常高的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用，能够加速与人CCR2基因或蛋白相关的领域的研究进展。为实现以上目的，本专利技术提供一种人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，包括：在非人动物细胞内导入人CCR2基因，使得该人CCR2基因在非人动物细胞中表达产生人源化的CCR2蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源CCR2基因的表达。本专利技术一些实施例中，利用基因编辑技术实现所述CCR2基因人源化动物细胞的构建，在所述非人动物细胞内形成人源化CCR2基因；可选的，所述非人动物为啮齿类动物；可选的，所述非人动物细胞为受精卵细胞；可选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法将小鼠的Ccr2基因的第3号外显子的全部或部分序列替换为人CCR2基因的第3号外显子的全部或部分序列。本专利技术一些实施例中，所述人CCR2基因选自下列组中的至少一种：(a)所述基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；(b)所述基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：7所示；(c)所述基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：8所示。本专利技术一些实施例中，所述构建方法使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术实现，所述构建方法具体包括：提供人CCR2基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。本专利技术一些实施例中，所述人CCR2基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CCR2基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子3’端同源的DNA片段；所述sgRNA在小鼠Ccr2基因的5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Ccr2基因的第3号外显子上。可选的，所述5’同源臂的DNA序列如SEQIDNO：9所示，所述3’同源臂的DNA序列如SEQIDNO：10所示；可选的，所述人CCR2基因编码区的DNA序列如SEQIDNO：11所示；可选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：28-37任一项所示；优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：21所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：35所示。本专利技术还提供一种人源化CCR2基因改造动物细胞，所述人源化CCR2基因改造动物细胞由上述人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法获得。本专利技术还提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法，将上述人源化CCR2基因改造动物细胞或者由所述人源化CCR2基因改造动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。可选的，所述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法还包括：将所述F0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，建立稳定的人源化CCR2基因改造小鼠品系。本专利技术还提供一种细胞或细胞系或细胞培养物，所述细胞或细胞系或细胞培养物来源于人源化CCR2基因改造动物模型或其子代，所述人源化CCR2基因改造动物模型由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得。本专利技术还提供一种组织或器官，所述组织或器官来源于人源化CCR2基因改造动物模型或其子代，所述人源化CCR2基因改造动物模型由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得。本专利技术还提供由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得的人源化CCR2基因改造动物模型、来源于所述人源化CCR2基因改造动物模型的细胞、细胞系或细胞培养物、组织、器官在与人CCR2基因或蛋白相关的领域中的应用。可选的，所述应用包括人CCR2基因功能研究、人CCR2抗体研究、针对人CCR2靶位点的药物制备和药效研究中的至少一种。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：/n在非人动物细胞内导入人CCR2基因，使得该人CCR2基因在非人动物细胞中表达产生人源化的CCR2蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源CCR2基因的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：
在非人动物细胞内导入人CCR2基因，使得该人CCR2基因在非人动物细胞中表达产生人源化的CCR2蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源CCR2基因的表达。


2.如权利要求1所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术实现所述CCR2基因人源化动物细胞的构建，在所述非人动物细胞内形成人源化CCR2基因；
可选的，所述非人动物为啮齿类动物；可选的，所述非人动物细胞为受精卵细胞；
可选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法将小鼠的Ccr2基因的第3号外显子的全部或部分序列替换为人CCR2基因的第3号外显子的全部或部分序列。


3.如权利要求2所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人CCR2基因选自下列组中的至少一种：
(a)所述基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；
(b)所述基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：7所示；
(c)所述基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：8所示。


4.如权利要求2所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术实现，所述构建方法具体包括：提供人CCR2基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。


5.如权利要求4所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人CCR2基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CCR2基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子3’端...

【专利技术属性】
技术研发人员：费俭，孙瑞林，王津津，慈磊，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31