CRISPR寡核苷酸和基因剪辑制造技术

本发明专利技术涉及用于制备核酸分子的方法，所述方法包含在反应混合物中进行聚合酶链反应(PCR)，所述反应混合物含有(i)双股核酸区段和(ii)至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与核酸在所述双股核酸区段的一个末端杂交，其中所述核酸分子是通过所述PCR反应产生，并且其中所述产物核酸分子在或靠近一个末端含有适于活体外转录的启动子。本发明专利技术解决了对于修饰基因组的高效系统和技术的需求且提供了相关优势。本发明专利技术部分地提供高效、有成本效益地制备CRISPR组分的组合物和方法。CRISPR组分的组合物和方法。CRISPR组分的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR寡核苷酸和基因剪辑
[0001]本申请是CN201580066476.8的分案申请。
[0002]优先权
[0003]本申请要求美国临时申请第62/061,961号(2014年10月9日提交)、第62/101,787号(2015年1月9日提交)和第62/218,826号(2015年9月15日提交)的权益，所述美国临时申请的揭露内容全部并入本文中供参考。
[0004]序列表
[0005]本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交且全部结合在此供参考。2015年10月7日创建的所述ASCII拷贝命名为LT00948PCT_SL.txt且大小是99,575个字节。


[0006]本专利技术大体上涉及对细胞进行基因修饰的组合物和方法。具体地说，本专利技术涉及CRISPR试剂和此类试剂的用途。

技术介绍

[0007]已经研发出多种基因组剪辑系统，如设计者锌指、转录活化因子样效应子(TALE)、CRISPR和归巢大核酸酶。这些系统存在的一个问题是其需要鉴别用于修饰的靶点和设计特异性针对那些位点的试剂，这往往费力且耗时。在一个方面中，本专利技术可以有效地设计、制备和使用基因组剪辑试剂。

技术实现思路

[0008]本专利技术部分地涉及用于剪辑核酸分子的组合物和方法。对于修饰基因组的高效系统和技术存在着相当大的需求。本专利技术解决了这种需求且提供了相关优势。
[0009]CRISPR系统不需要产生靶向特定序列的定制蛋白质，而是需要可以通过序列与目标互补的短RNA分子导向目标核苷酸序列(目标基因座)的单一Cas酶。
[0010]本专利技术部分地涉及增强这些系统有用性的CRISPR剪辑系统修饰。与基因剪辑系统有关的一个问题是为了设计和制备目标基因座特异性基因剪辑试剂所需的时间量和劳动量。本专利技术部分地提供高效、有成本效益地制备CRISPR组分的组合物和方法。
[0011]在一些特定方面，本专利技术涉及三种类型的序列特异性核酸结合活性。使用Cas9蛋白质作为实例，这些三种系统包括其中利用Cas9蛋白质的系统，所述系统具有(1)双股切割活性(例如单一Cas9蛋白质基因剪辑系统)；(2)切口酶活性(例如双Cas9蛋白质基因剪辑系统，称为“双切口酶”系统；和(3)无切割活性，但是保留核酸结合活性(例如“死亡”Cas9，称为dCas9，其适用于例如基因抑制、基因活化、DNA甲基化等)。
[0012]在一些方面中，本专利技术提供了制备核酸分子的方法，包括包含执行反应混合物中的聚合酶链反应(PCR)的方法，所述反应混合物含有(i)双股核酸区段和(ii)至少一种能够在双股核酸区段的一个末端与核酸杂交的寡核苷酸，其中核酸分子是通过PCR反应产生，且
其中产物核酸分子在或靠近一个末端含有适于活体外转录的启动子。在一些情况下，通过PCR反应产生的核酸分子编码长度为约20到约300(例如约20到约250、约20到约200、约35到约150、约70到约150、约40到约200、约50到约200、约60到约200、约60到约125等)个核苷酸的RNA分子。
[0013]通过本专利技术方法(例如连接)产生或由本专利技术方法所产生的核酸分子编码的RNA分子可以含有与目标基因座互补的序列区域(例如约10到约50、约20到约50、约30到约50、约15到约40、约15到约30等个核苷酸)。此类RNA分子还可以在生理条件(例如37℃、10mM Tris
‑
HCl pH 7.0、0.9％氯化钠)下形成一或多(例如二、三、四、五等)个发夹弯。另外，此类RNA分子可以是CRISPR RNA，如向导RNA分子。
[0014]在其它方面中，本专利技术包括制备核酸分子的方法，这些方法包含执行反应混合物中的聚合酶链反应(PCR)，所述反应混合物包含：(i)包含第一末端和第二末端的双股核酸区段；(ii)包含第一末端和第二末端的第一寡核苷酸，其中第一寡核苷酸的第二末端能够与双股核酸区段的第一末端杂交；和(iii)包含第一末端和第二末端的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸的第二末端能够与第一寡核苷酸的第一末端杂交，从而产生核酸分子。在一些情况下，产物核酸分子在或靠近一个末端含有一或多(例如一、二、三等)个适于活体外转录的启动子。另外，在一些情况下，产物核酸分子将编码一或多种CRISPR RNA(例如crRNA分子、tracrRNA分子、向导RNA分子等)。在一些情况下，反应混合物进一步包含第一引物和第二引物，其中第一引物能够在或靠近第二寡核苷酸的第一末端进行杂交且第二引物能够在或靠近双股核酸区段的第二末端进行杂交。
[0015]本专利技术还包括制备核酸分子的方法，所述方法包含执行反应混合物中的聚合酶链反应，所述反应混合物含有：(i)包含第一末端和第二末端的第一双股核酸区段；(ii)包含第一末端和第二末端的第二双股核酸区段；和(iii)至少一种包含第一末端和第二末端的寡核苷酸，其中寡核苷酸的第一末端能够在第一双股核酸区段的第一末端与核酸杂交以产生核酸分子，且其中寡核苷酸的第二末端能够在第二双股核酸区段的第二末端与核酸杂交以产生核酸分子。在一些情况下，产物核酸分子在或靠近一个末端含有一或多个适于活体外转录的启动子。
[0016]本专利技术进一步包括制备核酸分子的方法，这些方法包含执行反应混合物中的聚合酶链反应，所述反应混合物含有：(i)包含第一末端和第二末端的第一双股核酸区段；(ii)包含第一末端和第二末端的第二双股核酸区段；(iii)包含第一末端和第二末端的第一寡核苷酸；和(iv)包含第一末端和第二末端的第二寡核苷酸，其中第一寡核苷酸的第二末端能够在第二双股核酸区段的第一末端与核酸杂交，其中第二寡核苷酸的第二末端能够与第一寡核苷酸的第一末端杂交，其中第二寡核苷酸的第二末端能够与第二双股核酸区段的第一末端杂交。在一些情况下，产物核酸分子在或靠近(例如在10个碱基对内)一个末端含有一或多个适于活体外转录的启动子。
[0017]本专利技术还包括制备CRISPR RNA分子的方法，这些方法包含使两个或超过两个线性RNA区段在允许第一RNA区段的5'末端与第二RNA区段的3'末端共价连接以形成CRISPR RNA的条件下彼此接触。在一些情况下，从反应混合物组分中分离出CRISPR RNA分子(例如通过柱色谱法，如通过高效液相色谱法)。
[0018]本专利技术另外包括制备向导RNA分子的方法，这些方法包含：(a)分别制备crRNA分子
和tracrRNA分子以及(b)使crRNA分子和tracrRNA分子在允许crRNA的3'末端与tracrRNA的5'末端共价连接以产生向导RNA分子的条件下彼此接触。向导RNA分子可以具有与目标基因座互补的序列区域，所述序列区域具有至少10(例如约10到约50、约10到约40、约10到约35、约10到约30、约10到约25、约15到约25、约17到约22等)个核苷酸。在许多情况下，目标基因座是真核细胞中天然存在的染色体基因座。
[0019]本专利技术还包括包含两个经三唑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在细胞中进行同源重组的方法，该方法包括：(a)将Cas9蛋白/gRNA复合物引入细胞中，该复合物能够在细胞内存在的核酸分子中的目标基因座处产生双股断裂以产生切割的核酸分子，以及(b)将供体核酸分子引入细胞，其中步骤(a)在步骤(b)之前进行或其中步骤(b)在步骤(a)之前进行。2.一种在细胞中进行同源重组的方法，该方法包括：(a)使细胞与线性DNA区段在允许细胞吸收线性DNA区段的条件下接触，所述线性DNA区段在两个末端与目标基因座具有序列同源性，(b)等待一段时间，以及(c)使细胞与Cas9蛋白/gRNA复合物在允许Cas9蛋白/gRNA复合物被细胞吸收并切割目标基因座的条件下接触，其中步骤(a)在步...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：赛默飞世尔科技金尔特有限公司，
类型：发明
国别省市：