一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用技术方案

本发明专利技术涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于生物技术领域。本发明专利技术中的遍在染色质开放表达元件（UCOE序列）是在分析人UCOE序列（GenBank accession no.D28877.1）的基础上，删除了HNRPA2B1启动子序列，形成672 bp序列，并发现672 bp序列存在隐蔽拼接位点，将456、494隐蔽拼接位点进行突变设计合成了一种新型的UCOE元件。与天然UCOE序列相比，本发明专利技术的UCOE序列在提高哺乳动物细胞转基因表达水平上效果更为显著。

【技术实现步骤摘要】
一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用
本专利技术涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于生物

技术介绍
随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质类的数量和种类不断的增加，并已经成为医药工业的重要部分。哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translationalmodifications，PTMs)的功能，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞表达系统和HEK293细胞是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％批准上市的重组药物蛋白、重组抗体是采用CHO细胞和HEK293细胞生产的。但是哺乳动物细胞表达系统存在重组蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在哺乳动物细胞中表达的因素复杂，表达载体就是其中一个重要因素。遍在染色质开放元件(Ubiquitously-actingchromatinopeningelement,UCOE)是具有组织非特异性显性染色质重塑功能的DNA结构域，能使DNA不依赖于染色体插入位点，处于转录活性的“开放”状态。第一个UCOE是在TATA结合蛋白-蛋白酶体亚单位C5编码蛋白(TATA-bindingprotein-proteasomalsubunitC5-encodingprotein,TBP-PSMB1)基因的染色体位点中被鉴定的，随后在异质核糖核蛋白A2/B1-异染色质蛋白1Hs-γ(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1-heterochromatinprotein1Hs-gamma,HNRPA2B1-CX3)也发现了UCOE序列。自从UCOE发现以来，已经得到了广泛应用，研究证实在表达载体的启动子之前插入UCOE可以显著提高转基因转录的水平和稳定性，并且有效地保护启动子免受表观遗传沉默。HNRPA2B1-CX3序列为2.6kb无甲基化的CpG片段，另外1.5kb、4.0kb、8.0kb不同大小的UCOE片段都能提高CHO细胞中目的蛋白表达(NevilleJJ,OrlandoJ,MannK,McCloskeyB,AntoniouMN.2017.UbiquitousChromatin-openingElements(UCOEs):Applicationsinbiomanufacturingandgenetherapy.BiotechnolAdv,35:557～564)。公布号为CN101260384A的中国专利技术专利申请公开了具有遍在染色质开放表达元件(UCOE)的聚核苷酸；公布号为CN104531699A的中国专利技术专利申请公开了一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段。但两项公开的中国专利技术专利申请中UCOE序列来源于天然的UCOE序列，缺乏对有功能UCOE序列的特征分析，另一方面常用的UCOE元件较大，增加了载体构建难度，另外质粒的转染效率会随着载体的大小的增加而降低，从而限制了UCOE元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。此外，由于缺乏对有功能UCOE序列的分析，导致UCOE元件中没有功能或者有副作用的元件存在，导致UCOE的功能减弱或者增强作用被抵消。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种遍在染色质开放表达元件，该序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，实现重组蛋白在宿主细胞的高表达。本专利技术还提供了上述遍在染色质开放表达元件在提高哺乳动物表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。本专利技术还提供了包含上述遍在染色质开放表达元件的重组表达载体及其制备方法。本专利技术还提供了包含上述重组表达载体的哺乳动物表达系统及其制备方法。本专利技术还提供了上述重组表达载体、哺乳动物表达系统在表达重组蛋白的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种遍在染色质开放表达元件，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术中的遍在染色质开放表达元件(UCOE序列)是在分析人UCOE序列(GenBankaccessionno.D28877.1)的基础上，删除了HNRPA2B1启动子序列，形成672bp序列，并发现672bp序列存在隐蔽拼接位点，将456、494隐蔽拼接位点进行突变设计合成了一种新型的UCOE元件。与天然UCOE序列相比，本专利技术的UCOE序列在提高哺乳动物细胞转基因表达水平上效果更为显著。上述的遍在染色质开放表达元件的应用，所述遍在染色质开放表达元件在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。优选的，所述哺乳动物细胞表达系统中宿主细胞为CHO或HEK293细胞。本专利技术中的遍在染色质开放表达元件在用于外源蛋白的表达时，外源蛋白的表达量与不含有UCOE片段的系统相比可提高4倍以上，与天然的UCOE序列相比，可以提高1.5倍以上。重组表达载体，包含上述的遍在染色质开放表达元件；所述遍在染色质开放表达元件位于哺乳动物表达载体表达框的启动子上游。优选的，所述哺乳动物表达载体为pIRES-Neo载体。优选的，所述启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一种。本专利技术中的将上述UCOE序列插入哺乳动物细胞表达载体中，将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。上述的重组表达载体的制备方法，包括：1)人工合成或PCR扩增获得如SEQIDNO.3所示序列，并引入酶切位点，获得含酶切位点遍在染色质开放表达元件；2)使用与步骤1)中酶切位点相应的酶酶切哺乳动物表达载体，获得载体骨架片段；3)将步骤1)的含酶切位点遍在染色质开放表达元件和步骤2)载体骨架片段使用连接酶进行连接，即得。本专利技术中的制备方法能够简便、快速的获得包含上述UCOE序列的哺乳动物细胞表达载体。哺乳动物细胞表达系统，所述哺乳动物细胞表达系统中包含上述的重组表达载体。上述的哺乳动物细胞表达系统的制备方法，将所述的重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，即得；所述哺乳动物细胞系为CHO或HEK293细胞。上述的重组表达载体在表达重组蛋白方面的应用。上述的哺乳动物细胞表达系统在表达重组蛋白方面的应用。本专利技术中将上述UCOE序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子上游；在UCOE序列插入之前或之后将外源基因克隆插入到表达载体中；将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。本专利技术在分析人天然的UCOE序列的基础上，将隐蔽拼接位点进行突变设计合成一种新型UCOE序列，通过构建表达载体，测定该UCOE序列对EGFP以及西妥昔抗体表达的影响，表明本专利技术的UCOE序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，加有本专利技术提供的UCOE序列的表达载体在CHO细胞中，稳定细胞株的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遍在染色质开放表达元件，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种遍在染色质开放表达元件，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.如权利要求1所述的遍在染色质开放表达元件的应用，其特征在于：所述遍在染色质开放表达元件在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。


3.根据权利要求2所述的遍在染色质开放表达元件的应用，其特征在于：所述哺乳动物细胞表达系统中宿主细胞为CHO或HEK293细胞。


4.重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求1所述的遍在染色质开放表达元件；所述遍在染色质开放表达元件位于哺乳动物表达载体表达框的启动子上游。


5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述哺乳动物表达载体为pIRES-Neo载体。


6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一种。

【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，王冲，林艳，段树燕，樊振林，王蒙，米春柳，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41