用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用。该系统包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG‑U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明专利技术筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

【技术实现步骤摘要】
用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。
技术介绍
肥胖症(Obesity)是指体脂肪累积过多而对健康造成负面影响的身体状态，可能导致寿命减短及各种健康问题。肥胖是全世界主要的可预防死因，也是21世纪最重要的公共卫生问题之一。目前成人与儿童的肥胖盛行率都在上升，且女性较男性更常发生。2013年，包括美国医学会和美国心脏协会等数个医学会将肥胖定义为一种疾病，即为肥胖症。2015年，全球有6亿名成人(13％)和4200万名五岁以下的孩童有肥胖问题。世卫组织更是发出警告，指出超重和肥胖是全球引起死亡的第五大风险，全球每年“胖死”的人至少280万。尽管肥胖通常受到遗传和环境的共同影响，但肥胖症实际上是可遗传且由多基因作用的，只是不同人的易感性存在差异。在极少数情况下，遗传性肥胖症是由致病突变直接干扰能量稳态或脂肪沉积，例如人类单基因肥胖病的发生。其中，黑皮质素4受体(MC4R)基因的突变是造成人类先天性肥胖症最重要的基因之一。MC4R表达的增加可抑制食物的摄入，突变造成MC4R功能的丧失可引起肥胖、食欲亢进和严重的高胰岛素血症。因此，迫切需要开发出基于MC4R突变导致的先天性肥胖症动物模型以尽快解开发病机制谜团并为进一步的治疗奠定基础。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统。本专利技术的另一目的是提供用于MC4R基因编辑的gRNA及其表达载体。本专利技术的又一目的是提供所述的CRISPR/Cas9系统在构建MC4R基因突变的猪重组细胞中的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQIDNO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhangFenglab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQIDNO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：1)gRNA表达元件：U6gRNAscaffold；2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；6)转录终止信号：bGHpolyAsignal；7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGHpoly(A)signal序列元件。所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。特异融合基因具体如SEQIDNO：2中第911-6706位核苷酸所示。CMV增强子如SEQIDNO：2中第395-680位核苷酸所示。EF1a启动子如SEQIDNO：2中第682-890位核苷酸所示。WPRE序列元件如SEQIDNO：2第6722-7310位核苷酸所示。3’LTR序列元件如SEQIDNO：2中第7382-7615位核苷酸所示。bGHpoly(A)signal序列元件如SEQIDNO：2中第7647-7871位核苷酸所示。作为本专利技术的一种优选，针对猪MC4R基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQIDNO.3所示。作为本专利技术进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQIDNO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。


2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于针对猪MC4R基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于该表达载体表达SEQIDNO.22所示的gRNA，其靶点如SEQIDNO.18所示。


4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的针对猪MC4R基因的gRNA表达载体由SEQIDNO.26和SEQIDNO.27所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。


5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，刘璐，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，陶裴裴，黄彩云，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32