构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了用于构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明专利技术提供了一种制备重组细胞的方法：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了NF1基因的的定向基因编辑，模拟I型神经纤维瘤病的自然发病遗传特征，并获得了NF1基因定向突变的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育I型神经纤维瘤病模型猪奠定了基础。术培育I型神经纤维瘤病模型猪奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

技术介绍

[0002]I型神经纤维瘤病(又称为神经纤维瘤病I型)是一种具有非癌性肿瘤生长特征的常染色体显性遗传病，发病率为1/3000
‑
1/2600，约一半病例为家族遗传性，新生突变主要见于父源染色体。神经纤维瘤通常形成在皮肤上或皮下，以及在大脑和周围神经系统中，也可以在身体的其他部位，其标志性特征是多发咖啡牛奶斑和神经纤维瘤。
[0003]I型神经纤维瘤病是由NF1基因致病变异所致。NF1基因的蛋白产物为神经纤维瘤蛋白，属于三磷酸鸟苷水解酶(GTPase)激活蛋白(GAPs)家族，这些GAPs可刺激ras p21家族的内在GTPase活性。Ras可激活许多信号通路，包括干细胞因子SCF/c
‑
kit信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。当NF1基因发生突变时，通常导致截短的NF1蛋白，其不能与ras结合或调节其活性，导致ras蛋白过度活跃，造成细胞过度分裂，导致形成肿瘤。
[0004]研究I型神经纤维瘤病的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，在NF1基因敲除的小鼠中观察到了明显的I型神经纤维瘤病，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0005]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
[0006]同源重组(HDR)是通过序列同源性交换DNA序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链DNA(dsDNA)作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸(ssODN)作为HDR供体模板的优越性。首先，ssODN作为供体模板比dsDNA模板的插入位点特异性高，dsDNA模板容易产生随机插入。其次，ssODN对同源重组臂的长度要求比dsDNA模板更短，单侧30
‑
60个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的HDR，相比类似的dsDNA模板，其提供的插入效率更高。第三，dsDNA容易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合，而ssODN就不易产生这种现象。另外，dsDNAs对培养的细胞是有害的，线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低，并使细胞产生不良反应，而ssODN模板在这些方面就更有优势。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供构建NF1基因突变的I型神经纤维瘤病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。
[0008]本专利技术提供了一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。
[0009]用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白共转染猪细胞。
[0010]猪细胞、NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
‑
1.2μg NF1
‑
gRNA1：0.8
‑
1.2μg NF1
‑
gRNA4：1.8
‑
2.2μg NF1
‑
mutant
‑
ss216：3
‑
5μg NCN蛋白。
[0011]猪细胞、NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μg NF1
‑
gRNA1：1μg NF1
‑
gRNA4：2μg NF1
‑
mutant
‑
ss216：4μg NCN蛋白。
[0012]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0013]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0014]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0015]本专利技术还保护一种试剂盒，包括NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白。
[0016]本专利技术还保护一种试剂盒，包括NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和PRONCN蛋白。
[0017]本专利技术还保护一种试剂盒，包括NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和特异质粒。
[0018]所述试剂盒还包括大肠杆菌BL21(DE3)。
[0019]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0020]本专利技术提供了NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0021]本专利技术还提供了NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0022]本专利技术还提供了NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白共转染猪细胞；所述NF1
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示；所述NF1
‑
gRNA4为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示；所述NF1
‑
mutant
‑
ss216为SEQ ID NO：18所示的单链DNA分子；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：猪细胞、NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
‑
1.2μg NF1
‑
gRNA1：0.8
‑
1.2μg NF1
‑
gRNA4：1.8
‑
2.2μg NF1
‑
mutant
‑
ss216：3
‑
5μg NCN蛋白。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：(1)将质粒pKG
‑
GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌，然后加入IPTG并25℃诱导培养，然后收集菌体；(3)将收集的菌体进行菌体破碎，收集粗蛋白溶液；(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His6标签的融合蛋白；(5)采用具有His6标签的肠激酶酶切具有His6标签的融合蛋白，然后采用Ni
‑
NTA树脂去除具有His6标签的蛋白，得到纯化的NCN蛋白；质粒pKG
‑
GE4中具有SEQ ID NO：1中第5209
‑
9852位核苷酸所示的融合基因。6.一种试剂盒，包括NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和NCN蛋白；NF1
‑
gRNA1为权利要求2中所述的NF1
‑
gRNA1；NF1
‑
gRNA4为权利要求2中所述的NF1
‑
gRNA4；NF1
‑
mutant
‑
ss216为权利要求2中所述的NF1
‑
mutant
‑
ss216；NCN蛋白为权利要求2或3或5中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备神经纤维瘤病模型猪；(c)制备神经纤维瘤病细胞模型或神经纤维瘤病组织模型或神经纤维瘤病器官模型。7.一种试剂盒，包括NF1
‑
gRNA1、NF1
‑
gRNA4、NF1
‑
mutant
‑
ss216和PRONCN蛋白；NF1
‑
gRNA1为权利要求2中所述的NF1
‑
gRNA1；NF1
‑
gRNA4为权利要求2中所述的NF1
‑
gRNA4；NF1
‑
mutant
‑
ss216为权利要求2中所述的NF1
‑
mutant
‑
ss216；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备神经纤维瘤病模型猪；(c)制备神经纤维瘤病细胞模型或神经纤维瘤病组织模...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，王磊，程锐，方园，赵泽英，胡世芳，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：