制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良模型猪核移植供体细胞的方法及其专用基因编辑系统技术方案

本发明专利技术公开了制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良模型猪核移植供体细胞的方法及其专用基因编辑系统。本发明专利技术提供了制备重组猪细胞的方法：将HOXC13

【技术实现步骤摘要】
制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良模型猪核移植供体细胞的方法及其专用基因编辑系统


[0001]本专利技术属于生物
，具体属于基因编辑
，更具体涉及制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良(纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症)模型猪核移植供体细胞的方法及其专用基因编辑系统。

技术介绍

[0002]纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症(Pure hair and nail ectodermal dysplasia，PHNED)是一种常染色体隐性遗传疾病,主要临床表现为患者自出生后全身毛发及指甲完全缺失或营养不良，这严重影响患者外观及手部精细活动功能。该疾病可分为4型、5型、6型、7型和9型五种类型，其中HOXC13基因是引起纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症9型(Ectodermal dysplasia
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9，ECTD
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9)的致病基因。
[0003]HOXC13属于Hox(Homobox)基因家族Abd
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B类成员之一,与毛囊形成和毛发生长密切相关。毛发结构蛋白KP(角蛋白)和KAP(角蛋白关联蛋白)的表达都受HOXC13的严格调控，HOXC13基因表达水平与毛囊的形成和毛发的生长密切相关,并且对维持毛囊的正常形态至关重要。因此，对HOXC13的研究有助于提高人们对毛囊发育、毛发生长机制的认识，进而揭示ECTD
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9型的发病机理。
[0004]研究纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0005]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良模型猪核移植供体细胞的方法及其专用基因编辑系统。
[0007]本专利技术提供了一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：将HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞。
[0008]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0009]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0010]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0011]本专利技术还提供了HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术还提供了HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0013]本专利技术还提供了HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白。
[0015]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和PRONCN蛋白。
[0016]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和特异质粒。
[0017]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0018]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症模型猪；(c)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症细胞模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症组织模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症器官模型。
[0019]HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：0.8
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1.2μg HOXC13
‑
gRNA1：0.8
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1.2μg HOXC13
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gRNA4：3
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5μg NCN蛋白。
[0020]HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：1μg HOXC13
‑
gRNA1：1μgHOXC13
‑
gRNA4：4μg NCN蛋白。
[0021]猪细胞、HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
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1.2μg HOXC13
‑
gRNA1：0.8
‑
1.2μg HOXC13
‑
gRNA4：3
‑
5μg NCN蛋白。
[0022]猪细胞、HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μgHOXC13
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gRNA1：1μg HOXC13
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gRNA4：4μg NCN蛋白。
[0023]以上任一所述HOXC13
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0024]具体的，所述HOXC13
‑
gRNA1如SEQ ID NO：16所示。
[0025]具体的，所述HOXC13
‑
gRNA1如SEQ ID NO：10所示。
[0026]以上任一所述HOXC13
‑
gRNA4为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0027]具体的，所述HOXC13
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gRNA4如SEQ ID NO：17所示。
[0028]具体的，所述HOXC13
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gRNA4如SEQ ID NO：13所示。
[0029]以上任一所述NC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：将HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞；所述HOXC13
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示；所述HOXC13
‑
gRNA4为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
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22位核苷酸所示；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。2.HOXC13
‑
gRNA1、HOXC13
‑
gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；HOXC13
‑
gRNA1为权利要求1中所述的HOXC13
‑
gRNA1；HOXC13
‑
gRNA4为权利要求1中所述的HOXC13
‑
gRNA4；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症模型猪；(c)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症细胞模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症组织模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症器官模型。3.HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；HOXC13
‑
gRNA1为权利要求1中所述的HOXC13
‑
gRNA1；HOXC13
‑
gRNA4为权利要求1中所述的HOXC13
‑
gRNA4；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症模型猪；(c)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症细胞模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症组织模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症器官模型。4.HOXC13
‑
gRNA1、HOXC13
‑
gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用；HOXC13
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gRNA1为权利要求1中所述的HOXC13
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gRNA1；HOXC13
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gRNA4为权利要求1中所述的HOXC13
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gRNA4；所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症模型猪；(c)制备纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症细胞模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症组织模型或纯毛发及指趾甲型外胚叶发育不良症器官模型。5.一种试剂盒，包括HOXC13
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gRNA1、HOXC13
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gRNA4和NCN蛋白；HOXC13
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gRNA1为权利要求1中所述的HOXC13
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gRNA1；HOXC13
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gRNA4为权利要求1中所述的HOXC13
...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，王磊，程锐，赵泽英，方园，胡世芳，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：