用于诱导造血细胞分化的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用于诱导造血细胞分化的方法和组合物。本发明专利技术提供使多能细胞分化成造血细胞的培养平台、细胞培养基和方法。本发明专利技术进一步提供使用本文所公开的培养平台和方法产生的多能干细胞源造血细胞，所述培养平台和方法允许在不形成EB的情况下进行无饲养细胞的单层培养。具体地说，本发明专利技术的多能干细胞源造血细胞包括并且不限于iHSC、永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞。NKT细胞和B细胞。

【技术实现步骤摘要】
用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2016年7月26日，申请号为201680073326.4，专利技术名称为“用于诱导造血细胞分化的方法和组合物”。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2015年11月4日提交的美国临时申请第62/251,016号；2016年1月26日提交的国际申请第PCT/US16/14918号；和2015年5月16日提交的美国临时申请第62/337,093号的优先权，且所述申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。


[0004]本专利技术大体上涉及由多能干细胞制造所有造血谱系的细胞的组合物和方法。具体地说，本专利技术涉及由多能干细胞(包括人诱导多能干细胞)制造所有造血谱系的细胞的改进型培养平台。

技术介绍

[0005]人诱导多能干细胞(hiPSC)技术代表一种用于治疗多种血液恶性疾病和非血液恶性疾病(包括癌症)的治疗可行造血细胞的大有前景且潜在无限的来源。为了推进hiPSC和基因组工程化hiPSC技术作为造血细胞疗法的同种异体来源的前景，必需不仅能够高效地且可再现地产生造血干细胞和祖细胞(HSCs)，而且能够高效地且可再现地产生免疫效应细胞群体，包括T、B、NKT和NK淋巴细胞和其祖细胞的多种多样的亚群。
[0006]试管内衍生具有产生淋巴细胞的潜力的HSCs因在胚胎发育期间存在至少两波暂时且空间独特的血液形成：原始造血和永久造血而复杂化。原始造血是在胚胎外卵黄囊中起始且产生了短暂有限的造血谱系，主要包括原始红细胞系和骨髓细胞，但不包括HSCs。新生HSCs只在后来的永久造血波期间、由动脉血管内的特化内皮细胞祖细胞(称为永久性生血内皮细胞(HE))呈现。永久性HE然后经历内皮细胞向造血细胞的转变而产生HSCs，然后最终迁移到骨髓中，在骨髓中，在成年生命期间，其维持多谱系造血，包括T、B、NKT和NK淋巴细胞。因此，由多能干细胞产生HSCs和淋巴效应细胞取决于通过经充分设计和验证的方法和组合物使早期胚胎造血发育的复杂阶段向既定程序准确再现的能力。
[0007]数量有限的研究已经描述了hiPSCs在试管内向永久性HE的定向分化。hiPSCs用于治疗目的的主要障碍已经是，需要首先将此类细胞与鼠源或人源基质细胞在含有不明血清的培养基存在下共培养，以便维持多能性且诱导分化。另外，现有方案也已经使用了由以下组成的策略：培养iPSC以形成类胚胎体(EB)，所述类胚胎体是异质细胞聚集体，其包含多种分化细胞，包括外胚层、中胚层和内胚层细胞。那些程序需要使多能细胞聚集，例如通过离心而形成凝块，让细胞在孔中沉降且聚集或允许在悬浮培养物中发生被动聚集和凝块形成。所形成的EBs在分化诱导培养系统中维持一定时间长度，典型地为七到十天，以便发生适当分化，然后将EBs转移到粘附培养物中以便进一步成熟，或解离成单一细胞供进行细胞类型选择，以便进入后续分化步骤。(Kennedy等人，《细胞报道(Cell Reports)》2012:1722
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1735；Knorr等人，《干细胞转化医学(Stem Cells Translational Medicine)》2013(2):
274
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283)。举例来说，Kennedy等人教导产生EBs用于iPSCs分化，其中用胶原蛋白酶和胰蛋白酶处理多能细胞，以便刮下所述细胞以形成小聚集体，然后培养以形成EBs。EB形成已经表明可促进多能干细胞分化，然而，形成聚集体且随后形成EBs需要密集型劳动，在这个过程中，细胞数目最低限度地增加，三维EB聚集体中的细胞内容物不一致地且不均匀地暴露于培养基因子，由此产生处于可变分化阶段的异质细胞产物，且大大阻碍了制造工艺达到高效和流线化所必需的可扩展性和再现性。
[0008]因此，需要使干细胞分化成永久造血而不依赖于共培养或含血清培养基且不需要形成类胚胎体聚集体作为中间体的方法和组合物。

技术实现思路

[0009]本专利技术大体上涉及用于培养干细胞且使干细胞向造血细胞命运分化的细胞培养条件、培养基、培养平台和方法。
[0010]具体地说，本专利技术提供在无血清/无饲养层条件下且在可扩展的单层培养平台中，通过衍生自多能干细胞(包括hiPSCs)的永久性生血内皮细胞(HE)而不需要形成EB便产生造血细胞谱系的方法和组合物。可以根据本专利技术方法分化的细胞的范围为多能干细胞到专注于特定终末分化细胞和转分化细胞的祖细胞、直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，干细胞分化而产生的细胞的范围为多潜能干细胞或祖细胞到终末分化干细胞，和所有中间造血细胞谱系。
[0011]本专利技术提供由多能干细胞在单层培养中分化成且扩增造血谱系细胞的方法和组合物，包含使所述多能干细胞与BMP路径活化剂和任选存在的bFGF接触。因而，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得且扩增多能干细胞源中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而无需由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选存在的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触，具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞，在分化期间，所述永久性HE细胞还得到扩增。
[0012]本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用来说具有重要作用；并且费力且效率低。
[0013]本文中提供一种单层分化平台，其促进向永久性生血内皮细胞分化，从而衍生出造血干细胞和分化后代，例如T、B、NKT和NK细胞。得到证明的单层分化策略实现了增强的分化效率与大规模扩增的组合，从而能够在不同治疗应用中递送治疗上相关数目个多能干细胞源造血细胞。另外，本专利技术公开了使用本文所提供方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞，其实现了全范围的试管内分化、活体外调节以及活体内长期造血自我更新、重构和移植。如本文所用，iPSC源造血谱系细胞包括(但不限于)永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
[0014]本专利技术的一个方面提供一种用于获得多能干细胞源造血谱系细胞的培养平台，其包含：(i)包含ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和细胞因子以及任选存在的Wnt路径活化剂并且任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂的培养基，所述细胞因子选自由以下组成的组：
bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11，其中所述培养基适于由具有永久性生血内皮细胞潜能的中胚层细胞分化成和扩增永久性生血内皮细胞；(ii)包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂并且任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂的培养基，其中所述培养基适于获得具有永久性生血内皮细胞潜能的中胚层细胞；和(ii本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生具有增强的治疗特性的造血谱系细胞的方法，包含：a)获得包含一种或多种遗传印记的诱导多能干细胞(iPSCs)；b)引导所述iPSCs分化成造血谱系细胞，其中引导分化包含：(i)使iPSCs与包含BMP路径活化剂和任选存在的bFGF的组合物接触，以获得中胚层细胞；和(ii)使所述中胚层细胞与包含BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂的组合物接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞，其中具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的所述中胚层细胞能够提供造血谱系细胞；其中中胚层细胞和具有永久性HE潜能的中胚层细胞是在步骤(i)和(ii)中获得，而无需形成类胚胎体的步骤；其中所述造血谱系细胞包含永久性生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞(HSC)、造血多潜能祖细胞(MPP)、前T细胞祖细胞、前NK细胞祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞；和其中所述造血谱系细胞保留所述iPSCs中包含的所述遗传印记。2.根据权利要求1所述的方法，其中获得包含一种或多种遗传印记的iPSCs进一步包含：a)通过在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后进行基因组编辑而将一种或多种遗传印记引入iPSC中，其中所述遗传印记包含通过在所述iPSC的基因组中进行基因组插入、缺失或取代而引入的一种或多种基因修饰模式；或b)如下将一种或多种遗传印记引入iPSCi.获得对供者、疾病或治疗反应具有特异性的来源特异性免疫细胞，其中所述免疫细胞呈现能保留的治疗属性；和ii.将所述来源特异性免疫细胞重编程为iPSC；和任选地iii.通过在将所述来源特异性免疫细胞重编程为iPSC期间或之后进行基因编辑而将额外遗传印记引入步骤(ii)的iPSC中。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因修饰模式包含以下中的一种或多种：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或促进所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：菲特治疗公司，
类型：发明
国别省市：