一种稳定敲除METTL7B基因的脑胶质瘤重组细胞及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定敲除METTL7B基因的脑胶质瘤重组细胞及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术要结解决的技术问题是：如何构建METTL7B敲除的脑胶质瘤细胞模型。为解决该技术问题，本发明专利技术提供一种重组细胞，所述重组细胞不含有METTL7B蛋白的编码基因或所述METTL7B蛋白的表达量降低或所述METTL7B蛋白的活性降低，所述METTL7B蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。本发明专利技术还提高该重组细胞的构建方法。本发明专利技术获得的重组细胞为人METTL7B蛋白功能和作用机制的研究提供了可用的细胞模型，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供重要的研究工具。研究工具。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定敲除METTL7B基因的脑胶质瘤重组细胞及其构建方法


[0001]本专利技术基因工程
，具体涉及一种稳定敲除METTL7B基因的脑胶质瘤重组细胞及其构建方法。

技术介绍

[0002]脑胶质瘤(Glioma)是源自神经上皮肿瘤的统称，是最常见的颅内肿瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的原发性颅内肿瘤，其恶性率是全身肿瘤的2％～3％，年发病率为3～8人/10万人口。脑胶质瘤可分为低级别胶质瘤和高级别胶质瘤。高级别胶质瘤具有迅速性侵袭生长、血管不正常增生、容易破坏脑组织等生物学特性，这使得恶性胶质瘤治疗难度大，且预后较差，经过系统治疗后其中位生存时间仍少于15个月。目前，对于脑胶质瘤的治疗仍以手术切除为主，术后辅以放化疗。但因短时间的复发和耐药性，治疗效果不满意。因此，脑胶质瘤防治形势依然非常严峻。因此，探索脑胶质瘤发生和发展的分子机制，对于深入了解其发病机制，以及疾病的防控和治疗都非常关键。
[0003]METTL7B(methyltransferase like 7B)是甲基化转移酶样家族成员之一，其蛋白结构包含一个S
‑
腺苷基甲硫氨酸结合域(S
‑
adenosylmethionine binding site,SAM binding site)。METTL7B参与多种恶性肿瘤的侵袭及迁移的调控。METTL7B参与乳腺癌细胞的基因组稳定性和肿瘤侵袭。METTL7B能通过促进肿瘤上皮细胞向间质细胞的转变途径，从而导致甲状腺癌细胞侵袭和迁移的发生。最新研究表明，METTL7B在脑胶质瘤组织中较其他成员表达升高最为明显并与生存期呈负相关。

技术实现思路

[0004]本专利技术要结解决的技术问题是：如何构建METTL7B敲除的脑胶质瘤细胞模型。
[0005]为解决上述技术问题，第一个方面，本专利技术提供重组细胞，所述重组细胞不含有METTL7B蛋白的编码基因或所述METTL7B蛋白的表达量降低或所述METTL7B蛋白的活性降低，所述METTL7B蛋白为下述任一种：
[0006]A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
[0007]A2)、A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与METTL7B蛋白相关的蛋白质；
[0008]A3)、在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0009]其中，SEQ ID No.1由244个氨基酸残基组成。
[0010]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0011]所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
[0012]进一步地，上述的重组细胞中，所述重组细胞按照下述的方法构建。
[0013]进一步地，上述重组细胞的受体细胞为动物细胞。
[0014]进一步地，上述重组细胞的受体细胞为人细胞。
[0015]进一步地，上述重组细胞的受体细胞为人胶质瘤细胞。
[0016]进一步地，上述重组细胞的受体细胞为U251细胞。
[0017]第二个方面，本专利技术提供构建上述的重组细胞的方法，所述方法包括将受体细胞中的METTL7B基因敲除获得所述重组细胞，所述METTL7B基因为下述任一种：
[0018]g1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
[0019]g2)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
[0020]g3)、与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述METTL7B蛋白的DNA分子。
[0021]进一步地，上述的方法中，所述将受体细胞中的METTL7B基因敲除包括：使所述受体细胞感染慢病毒，所述慢病毒表达靶向所述METTL7B基因的gRNA和Cas9蛋白。
[0022]进一步地，上述的方法中，所述gRNA的靶标序列为SEQ ID No.4(5
’‑
GTTCTACCCACCGGGCTGCA
‑3’
)。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，所述慢病毒由重组质粒pLV
‑
U6
‑
gRNA1
‑
METTL7B
‑
puro、质粒psPAX2和质粒pMD2G共转染宿主细胞制备获得。
[0024]重组质粒pLV
‑
U6
‑
gRNA1
‑
METTL7B
‑
puro可表达靶向METTL7B基因的sgRNA和Cas9蛋白，所述重组质粒pLV
‑
U6
‑
gRNA1
‑
METTL7B
‑
puro以骨架质粒pLV
‑
U6
‑
puro
‑
Cas9为基础构建获得。
[0025]进一步地，上述的方法中，所述将受体细胞中的METTL7B基因敲除为为将所述受体细胞中的所述METTL7B基因进行如下突变：在SEQ ID No.3第293位和294位核苷酸之间插入了1个核苷酸T。
[0026]进一步地，上述的方法中，所述受体细胞为下述任一项：
[0027]C1)、动物细胞；
[0028]C2)、哺乳动物细胞；
[0029]C3)、人细胞；
[0030]C4)、人胶质瘤细胞；
[0031]C5)、U251细胞。
[0032]在本专利技术的一个实施例中，相对于野生型U251，敲除METTL7B(gRNA1)的U251细胞的两条染色体中，METTL7B基因在SEQ ID No.3第293位和294位核苷酸之间添加了1个核苷酸T(位于第1外显子)，导致METTL7B发生移码突变，进而导致METTL7B无法正常表达蛋白实现了METTL7B基因的敲除。
[0033]第三个方面，本专利技术提供与上述重组细胞相关的生物材料，所述生物材料选自下述任一种：
[0034]B1)、抑制或降低上述METTL7B蛋白的编码基因的表达或上述METTL7B蛋白的活性的核酸分子；
[0035]B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0036]B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0037]B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
[0038]进一步地，上述的生物材料中，B1)所述核酸分子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
No.4。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋惠彬，马磊，邹畅，王继刚，毛捷，刘东成，钟富花，张思雨，田璎，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：