一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，且公开了一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法，通过基因工程的方法，获得过表达eIF3i亚基的HEK293细胞株，提高了细胞的增殖速度。该细胞株应用于重组蛋白表达，加快了重组蛋白的生产速率，大大提高了重组蛋白得表达量。HEK293细胞产生重组蛋白的量是4.3mg/30ml，而HEK293

【技术实现步骤摘要】
一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法。

技术介绍

[0002]目前新型生物医药产品中有相当多数量的生物制剂是通过重组细胞表达产生的，其中大部分蛋白质，均产生于哺乳动物表达系统。HEK293细胞和CHO细胞是在真核蛋白表达系统中最常用的细胞，HEK293作为一款全能细胞，在病毒生产和重组蛋白生产中有着举足轻重的地位，但现阶段科研实验中，最常用的生物药学蛋白制备宿主却是CHO，原因是其拥有极高的生产力(批量培养0.1
‑
1g/L，分批培养1
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10g/L)，适合在相对较短的时间内大规模工业化培养。CHO细胞不能进行所有类型的人类糖基化，因为它们缺乏某些糖转移酶，如α(2
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6)唾液糖基转移酶和α(1
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3/4)核糖基转移酶。与CHO细胞相比，HEK293细胞表现出更大的谷氨酸γ
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羧化能力和酪氨酸残基的磺化能力，这些翻译后修饰是治疗性糖蛋白所必需的。HEK293稳定细胞系所产生的蛋白产量仅有CHO细胞系的五分之一，细胞培养时间也慢于CHO细胞(HEK293翻倍时间为33h，CHO为14
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17h)，导致在重组蛋白生产时不仅需要大量的转染级质粒DNA，还需要更大规模的培养体系和更久的培养时间。
[0003]真核翻译因子(eukaryotic initiation factors,eIFs)是指参与真核翻译起始这一过程的蛋白质，目前发现了至少12种不同的起始因子，不同的真核起始因子与核糖体、mRNA和起始tRNA之间的相互作用，来完成真核生物的翻译起始。其中eIF3还参与细胞生长和细胞周期的调控。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]本专利技术涉及一种稳定表达人的eIF3i亚基基因的HEK293细胞株及其构建方法和应用。
[0006](二)技术方案
[0007]一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法，所述构建方法如下：
[0008]S1：通过基因合成人的eIF3i亚基基因并构建质粒；再将构建的质粒与慢病毒的两个包装质粒psPAX2、pMD2.G同时转入293T细胞，形成包装好的慢病毒；
[0009]S2：将慢病毒进行浓缩后，使其感染HEK293细胞，构建未药筛的多克隆HEK293
‑
eIF3i的细胞株。
[0010]S3：进行药物筛选，用嘌呤霉素(puro)筛选，直至对照HEK293的细胞全部死亡，获得多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株。
[0011]S4：检测多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞的增殖速度。
[0012]S5：多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞和HEK293细胞分别转染同一重组蛋白，对比重组蛋白的表达量。
[0013]S6：单克隆挑选：通过无限稀释的方法从多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞中挑选出单克隆，经培养获得单克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株(HEK293
‑
eIF3i1
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200)。
[0014]S7：单克隆细胞株分别转染重组蛋白，对比重组蛋白得表达量，得到表达量最高的单克隆细胞株。
[0015]优选的，所述S1中通过基因合成eIF3i的碱基序列，插入到质粒plvx
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CMV
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MCS
‑
IRES
‑
Puro的多克隆酶切位点，得到表达质粒载体plvx
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CMV
‑
eIF3i
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IRES
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Puro。
[0016]优选的，所述S1中eIF3i的氨基酸序列为：
[0017]MKPILLQGHERSITQIKYNREGDLLFTVAKDPIVNVWYSVNGERLGTYMGHTGAVWCVDADWDTKHVLTGSADNSCRLWDCETGKQLALLKTNSAVRTCGFDFGGNIIMFSTDKQMGYQCFVSFFDLRDPSQIDNNEPYMKIPCNDSKITSAVWGPLGECIIAGHESGELNQYSAKSGEVLVNVKEHSRQINDIQLSRDMTMFVTASKDNTAKLFDSTTLEHQKTFRTERPVNSAALSPNYDHVVLGGGQEAMDVTTTSTRIGKFEARFFHLAFEEEFGRVKGHFGPINSVAFHPDGKSYSSGGEDGYVRIHYFDPQYFEFEFEA。
[0018]优选的，所述S2中病毒感染HEK293的方法为：将培养至对数生长期的HEK293细胞，密度调至0.7
×
106cells/mL，24孔板，500uL/孔，MOI＝5，病毒滴度为2.38E+7，所需病毒量为63uL，每孔加6ug/mL的polybrene。感染后24h后换液，用完全培养基培养两天，得到未药筛的多克隆HEK293
‑
eIF3i的细胞株。
[0019]优选的，所述S3中药筛获得稳转的多克隆HEK293
‑
eIF3i的细胞株的方法为：将未药筛的多克隆HEK293
‑
eIF3i的细胞株培养至对数生长期，将细胞密度调至0.7
×
106cells/mL，加入5ug/mL的puro，2mL至六孔板中，150rmp，37℃，5％CO2培养两天，进行活细胞计数(台盼蓝)，然后细胞进行传代，离心换液，用含有5ug/mL的puro的完全培养基继续培养，至阴性对照(未感染病毒的HEK293)全部死亡。计HEK293
‑
eIF3i的活率，获得稳定的多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株。
[0020]优选的，所述S6中单克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株的培养方法为：将多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株培养至对数生长期，离心后用新鲜培养基重悬，进行细胞计数，将其进行梯度稀释，并稀释至96孔板铺四块板中，培养后显微镜观察细胞的生长状况，排除多克隆的孔，培养后每孔加新鲜培养基进行培养，当细胞超过96孔板中底面积的1/2时，将细胞吸出，养至24孔板，继续扩大培养，得到单克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株。
[0021](三)有益的技术效果
[0022]HEK293细胞相比CHO细胞具有更好的翻译后糖基化修饰能力，能表达一些CHO细胞不能表达的重组蛋白，但由于其低于CHO的细胞增殖速度和蛋白表达水平，HEK293生物药学蛋白制备中的应用低于CHO细胞。eIF3i的亚基的过表达，会影响整体蛋白翻译水平，使得细胞的增殖速度和细胞内蛋白表达速率都得到了提升。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法，其特征在于：所述构建方法如下：S1：通过基因合成人的eIF3i亚基基因并构建质粒；再将构建的质粒与慢病毒的两个包装质粒psPAX2、pMD2.G同时转入293T细胞，形成包装好的慢病毒；S2：将慢病毒进行浓缩后，使其感染HEK293细胞，构建未药筛的多克隆HEK293
‑
eIF3i的细胞株；S3：进行药物筛选，用嘌呤霉素进行筛选，直至对照HEK293的细胞全部死亡，获得多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株；S4：检测多克隆HEK293
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eIF3i细胞的增殖速度；S5：多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞和HEK293细胞分别转染同一重组蛋白，对比重组蛋白的表达量；S6：单克隆挑选：通过无限稀释的方法从多克隆HEK293
‑
eIF3i细胞中挑选出单克隆，经培养获得单克隆HEK293
‑
eIF3i细胞株；S7：单克隆细胞株分别转染重组蛋白，对比重组蛋白得表达量，得到表达量最高的单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法，其特征在于：所述S1中通过基因合成eIF3i的碱基序列，插入到质粒plvx
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CMV
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MCS
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IRES
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Puro的多克隆酶切位点，得到表达质粒载体plvx
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CMV
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eIF3i
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IRES
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Puro。3.根据权利要求1所述的构建高表达重组蛋白的HEK293细胞株的方法，其特征在于：所述S1中eIF3i的氨基酸序列为：MKPILLQGHERSITQIKYNREGDLLFTVAKDPIVNVWYSVNGERLGTYMGHTGAVWCVDADWDTKHVLTGSADNSCRLWDCETGKQLALLKTNSAVRTCGFDFGGNIIMFSTDKQMGYQCFVSFFDLRDPSQIDNNE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，魏迎东，李海兰，徐文正，
申请(专利权)人：江苏华抗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：