诱导胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法。所提供的方法包括：对改造的胚胎干细胞诱导分化为巨核细胞的步骤；所述改造的胚胎干细胞相较于未改造的胚胎干细胞，所述改造的胚胎干细胞所表达的SHMT2蛋白量降低。经由该方法可以高效制备巨核细胞和血小板。板。

【技术实现步骤摘要】
诱导胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种诱导胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的方法。

技术介绍

[0002]血小板作为人体血液的一种关键组分，具有凝血、止血的生理功能。正常人体中血小板的含量维持相对恒定的状态，当其水平低于正常值下限，将大大增加人体出血的风险。在临床上，血小板成分输注已经被广泛应用于多种因素导致的血小板减低症的治疗。然而，由于捐献者数量有限、血小板成分采集难度较高、血小板储存条件苛刻且保质期短，导致血小板供应长期处于供不应求的状态，无法满足现阶段临床治疗的需求。
[0003]血小板来源于人体骨髓、肺脏等器官中的巨核细胞。尽管巨核细胞在人体中含量极其稀少(在骨髓有核细胞占比仅为0.05％)，由于巨核细胞具有强大的产板能力(平均每个巨核细胞能够产生500个以上血小板)，因而能够有效维持血小板数量始终处于生理稳态。因此，外源性输注巨核细胞作为血小板成分输血的替代治疗策略，在治疗各种原因导致的血小板减低症中体现出良好的应用前景。
[0004]为了解决体内巨核细胞来源稀缺、分离困难的应用瓶颈，我们借助干细胞体外诱导分化策略，利用人多能干细胞为巨核细胞体外制备提供新的种子来源。人多能干细胞具有高度的自我更新能力及多向分化潜能，能够在特定的体外诱导条件下分化成为巨核细胞及成熟血小板。人们一直在为建立高效稳定的巨核分化体系而不懈探索，这些探索主要围绕建立模拟巨核发育的分化微环境展开，并逐步发展出基质细胞共培养、细胞因子和小分子化合物筛选添加、三维分化结构构建等优化策略。
[0005]然而，由于对巨核细胞发育分化机制认识不足，目前人多能干细胞来源的巨核细胞制备存在诱导效率低下，分化细胞体外产板能力弱等问题，成为困扰干细胞来源巨核细胞走向临床应用的障碍。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一是在一定程度上解决上述问题之一。本专利技术针提供了一种诱导胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的方法。应用该方法可以高效制备巨核细胞。
[0007]本专利技术基于专利技术人下列研究完成的：
[0008]专利技术人在研究过程中发现：线粒体介导的细胞代谢在干细胞增殖分化调控中发挥着关键作用。例如，造血干细胞维持其静息状态时，细胞能量供应主要依赖于糖酵解，但是当造血干细胞向下游血细胞分化时，细胞则迅速切换到氧化磷酸化为主的供能状态中。在该能量代谢转换过程中，伴随着细胞内线粒体的增多和活化。而在研究过程中发现，一种被称为丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT2)可能在造血发育过程中扮演了重要角色。SHMT2是一类只在线粒体中存在的酶，其在细胞丝氨酸代谢、单碳代谢及tRNA合成中起到重要作用，SHMT2介导的丝氨酸分解代谢对于甲硫氨酰tRNAs正确翻译、起始和维持是必需的。此外，
SHMT2作为在细胞呼吸及线粒体代谢中发挥重要作用一种酶，其在多能干细胞造血命运决定中很有可能也有着重要作用。由此，专利技术人通过将SHMT2基因从人胚胎干细胞系中敲除，并在此基础上设计了一种定向诱导人胚胎干细胞向巨核细胞分化的培养体系，发现SHMT2敲除胚胎干细胞具有更强的巨核分化潜能，细胞向巨核谱系的分化效率显著提升。本专利技术所提供的技术方案为高效制备人胚胎干细胞来源的巨核细胞和血小板提供了一种新的技术途径。
[0009]为此，本专利技术的第一方面提供了一种诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法，包括：对改造的胚胎干细胞诱导分化为巨核细胞的步骤；所述改造的胚胎干细胞相较于未改造的胚胎干细胞，所述改造的胚胎干细胞所表达的SHMT2蛋白量降低。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述改造的胚胎干细胞通过下述方法中的至少一种获得：
[0011](1)包括使得胚胎干细胞中的SHMT2基因表达沉默或者表达降低；
[0012](2)包括使用SHMT2抑制剂使得胚胎干细胞中SHMT2基因表达沉默或者表达降低。
[0013]本专利技术的第二方面提供了一种诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法，包括：
[0014](1)利用第一培养基对改造的胚胎干细胞进行第一诱导处理，获得第一诱导产物，其中所述第一培养基中含有骨形态发生蛋白
‑
4(Bone morphogenetic protein
‑
4，BMP
‑
4)、激活素(Activin A)、CHIR
‑
99021和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)；
[0015](2)利用第二培养基对所述第一诱导产物进行第二诱导处理，获得第二诱导产物，其中所述第二培养基中含有bFGF、SB431542和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)；
[0016](3)利用第三培养基对所述第二诱导产物进行第三诱导处理，以便获得第三诱导产物，其中所述第三培养基中含有重组人干细胞因子(Recombinant human stem cell factor，SCF)、促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、血管内皮生长因子、白介素
‑
3(Interleukin
‑
3，IL
‑
3)和Fms相关酪氨酸激酶3配体(Fms
‑
like Tyrosine Kinase 3Ligand，Flt3
‑
L)。
[0017]根据本专利技术的实施例，以上所述诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法进一步包括如下技术特征：
[0018]根据本专利技术的实施例，步骤(1)中所述第一培养基包括：
[0019]IMDM基础培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，
[0020]F
‑
12基础培养基(Ham's F
‑
12Nutrient Mixture)，
[0021]牛血清白蛋白，
[0022]胆固醇，
[0023]亚麻酸(Linolenic acid)，
[0024]亚油酸(Linoleic acid)，
[0025]L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸(L
‑
Ascorbic acid 2
‑
phosphate)，
[0026]α
‑
硫代甘油(α
‑
Monothioglycerol，α
‑
MTG)，
[0027]谷氨酰胺，
[0028]PFHM
‑
II培养基(Protein
‑
Free Hybridoma Medium II)，
[0029]胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒(Ihsulin
‑
Transferrin
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法，包括：对改造的胚胎干细胞诱导分化为巨核细胞的步骤；所述改造的胚胎干细胞相较于未改造的胚胎干细胞，所述改造的胚胎干细胞所表达的SHMT2蛋白量降低。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造的胚胎干细胞通过选自下述方法中的至少一种获得：(1)包括使得胚胎干细胞中的SHMT2基因表达沉默或者表达降低；(2)包括使用SHMT2抑制剂使得胚胎干细胞中SHMT2基因表达沉默或者表达降低。3.一种诱导胚胎干细胞分化为巨核细胞的方法，包括：(1)利用第一培养基对改造的胚胎干细胞进行第一诱导处理，获得第一诱导产物，其中所述第一培养基中含有BMP
‑
4、激活素、CHIR
‑
99021和bFGF；(2)利用第二培养基对所述第一诱导产物进行第二诱导处理，获得第二诱导产物，其中所述第二培养基中含有bFGF、SB431542和VEGF；(3)利用第三培养基对所述第二诱导产物进行第三诱导处理，以便获得第三诱导产物，其中所述第三培养基中含有SCF、TPO、VEGF、IL
‑
3和Flt3
‑
L。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一培养基包括：IMDM基础培养基，F
‑
12基础培养基，牛血清白蛋白，胆固醇，亚麻酸，亚油酸，L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸，α
‑
硫代甘油，谷氨酰胺，PFHM
‑
II培养基，胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒，青霉素
‑
链霉素，BMP
‑
4，激活素，CHIR
‑
99021,bFGF；优选地，所述第一培养基包括：IMDM基础培养基，F
‑
12基础培养基，2～5μg/mL的牛血清白蛋白，0.1～0.5％的胆固醇，0.1μg/mL亚麻酸，0.1μg/mL亚油酸，
0.05mg/mL的L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸，0.003％～0.005％的α
‑
硫代甘油，0.5％～2％的谷氨酰胺，3％～8％的PFHM
‑
II培养基，0.5％～2％的胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒，0.5％～2％的青霉素
‑
链霉素，10～30ng/mL的BMP
‑
4，10～30ng/mL的激活素，1～3μmol/L的CHIR
‑
99021,10～30ng/mL的bFGF；任选地，步骤(1)中所述第一诱导处理的时间为24～48小时。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二培养基包括：IMDM基础培养基，F
‑
12基础培养基，牛血清白蛋白，胆固醇，亚麻酸，亚油酸，L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸，α
‑
硫代甘油，谷氨酰胺，PFHM
‑
II培养基，胰岛素
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，李艳华，李基晟，张博文，何丽娟，岳文，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：