一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，本发明专利技术提供了一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。本发明专利技术以簸箕柳组培苗及容器苗叶片为材料，利用酶解法(纤维素酶R10和离析酶R10)游离叶肉原生质体，然后利用聚乙二醇(PEG)法将载体p2GWF7导入得到的簸箕柳叶肉原生质体中，建立簸箕柳原生质体瞬时表达体系。利用本发明专利技术方法最终得到的原生质体的产量高达1.57

【技术实现步骤摘要】
一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。

技术介绍

[0002]簸箕柳(Salixsuchowensis)隶属于杨柳科柳属，是原产于中国的小灌木，与木本植物模式物种
‑
杨树是姊妹属。但与杨树相比，簸箕柳幼龄期短，一般杂交当年即可开花，而且植株矮小，可以进行大规模的田间实验，是进行木本植物遗传学研究的理想材料。随着簸箕柳全基因组测序、组装的完成，该树种有望成为新一代木本植物模式物种。但簸箕柳高效、稳定的遗传转化体系尚未建立，制约了其功能基因组学的研究。原生质体经过处理可以摄取病毒、质粒、DNA等各种大分子，是进行遗传转化的理想受体材料，广泛应用于植物分子生物学与基因工程研究。为此，有必要提出一种簸箕柳叶肉原生质体游离及瞬时表达体系建立的方法，为高通量开展簸箕柳关键基因的功能研究与利用提供有力工具。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，包括如下步骤：
[0006](1)酶溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、KCl和MES缓冲液，进行第一水浴保温，然后加入纤维素酶R10、离析酶R10，进行第二水浴保温，然后冰浴，使溶液温度降为室温，再向溶液中加入CaCl2、BSA、β
‑
巯基乙醇，混匀后依次进行过滤、真空渗透，去除气泡，得酶溶液；
[0007](2)酶解：将簸箕柳叶片沿垂直叶脉方向切成叶条，浸泡于步骤(1)所得酶溶液中，真空渗透25～35min，然后室温避光，酶解3.5～4.5h；
[0008](3)W5溶液配制：在无菌双蒸水中加入NaCl、CaCl2、KCl和MES缓冲液，混匀得W5溶液；
[0009](4)MMG溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、MgCl2和MES缓冲液，混匀得MMG溶液；
[0010](5)将步骤(2)酶解完成的簸箕柳叶片与等体积的W5溶液混合，得混合液；
[0011](6)对所得混合液进行过滤、离心，吸掉上清液，沉淀部分即为原生质体；
[0012](7)加入W5溶液重悬原生质体，冰浴25～35min，原生质体沉淀到底部，吸掉上清，将沉淀重悬于MMG溶液中，得簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。
[0013]优选的，步骤(1)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述KCl的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6，所述第一水浴保温的温
度为50～60℃，所述第一水浴保温的时间为4～6min，所述纤维素酶R10的浓度为10～20g/L，所述离析酶R10的浓度为3～5g/L，所述第二水浴保温的温度为50～60℃，所述第二水浴保温的时间为8～12min，所述CaCl2的浓度为8～12mM，所述BSA的浓度为0.05～0.15wt％，所述β
‑
巯基乙醇的浓度为4～6mM，所述过滤的孔径为0.2～0.4mm，所述真空渗透的时间为10～20min。
[0014]优选的，步骤(2)中所述簸箕柳叶片的来源为簸箕柳容器苗或簸箕柳组培苗，所述叶条的宽度为0.5～1mm，所述叶条与酶溶液的用量比为0.5～1.5g:100mL，所述酶解在摇动条件下进行，所述摇动的转速为45～55rpm。
[0015]优选的，步骤(3)中所述NaCl的浓度为150～155mM，所述CaCl2的浓度为120～130mM，所述KCl的浓度为4～6mM，所述MES缓冲液的浓度为1～3mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6；
[0016]步骤(4)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述MgCl2的浓度为10～20mM，所述MES缓冲液的浓度为3～5mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6。
[0017]优选的，步骤(6)中所述过滤采用细胞筛网进行，所述细胞筛网的孔径为65～75μm，所述离心的转速为80
×
g～120
×
g，所述离心的时间为1～3min；
[0018]步骤(7)中所述W5溶液的用量为0.8～1.2mL，所述MMG溶液的用量为0.8～1.2mL。
[0019]本专利技术还提供了上述游离方法得到的簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。
[0020]本专利技术还提供了一种簸箕柳叶肉原生质体瞬时表达体系的建立方法，包括如下步骤：
[0021](1)提取8～12μl的p2GWF7质粒DNA；
[0022](2)加入80～120μl簸箕柳叶肉原生质体悬浮液，混匀得混合液a；
[0023](3)加入与所得混合液a等体积的PEG溶液，混匀，室温孵育10～15min，间歇混匀，得混合液b；
[0024](4)加入所得混合液b的两倍体积的W5溶液，混匀，终止转化；
[0025](5)室温离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于WI溶液中，得原生质体WI溶液；
[0026](6)利用无菌小牛血清对6孔细胞培养皿润洗1～2s；
[0027](7)将所述原生质体WI溶液移入细胞培养皿中，室温黑暗孵育10～14h；
[0028](8)室温离心，弃掉上清液，簸箕柳叶肉原生质体瞬时表达体系建立完成。
[0029]优选的，步骤(1)中所述p2GWF7质粒DNA的浓度为1.5～2.5μg/μl；
[0030]步骤(2)中所述簸箕柳叶肉原生质体悬浮液的细胞个数为1.5
×
104～2.5
×
104。
[0031]优选的，步骤(3)中所述的PEG溶液在转化前1～1.5h配制，所述PEG溶液的配制过程为在无菌双蒸水中加入35～45％PEG 4000、0.1～0.3M甘露醇、80～120mM CaCl2；
[0032]步骤(4)中所述W5溶液的配制过程为在无菌双蒸水中加入150～155mM NaCl、120～130mM CaCl2、4～6mM KCl和1～3mM MES缓冲液，所述MES缓冲液的pH值为5～6；
[0033]步骤(5)和步骤(8)中所述室温离心的转速独立为80
×
g～120
×
g，所述室温离心的时间独立为1～3min。
[0034]优选的，步骤(5)中所述WI溶液的用量为0.8～1.2mL，所述WI溶液的配制过程为在无菌双蒸水中加入0.4～0.6M甘露醇、18～22mM KCl和3～5mM MES缓冲液，所述MES缓冲液的pH值为5～6；
[0035]步骤(6)中所述无菌小牛血清的浓度为4～6％。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0037]本专利技术以簸箕柳组培苗及容器苗叶片为材料，利用酶解法游离叶肉原生质体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)酶溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、KCl和MES缓冲液，进行第一水浴保温，然后加入纤维素酶R10、离析酶R10，进行第二水浴保温，然后冰浴，使溶液温度降为室温，再向溶液中加入CaCl2、BSA、β
‑
巯基乙醇，混匀后依次进行过滤、真空渗透，去除气泡，得酶溶液；(2)酶解：将簸箕柳叶片沿垂直叶脉方向切成叶条，浸泡于步骤(1)所得酶溶液中，真空渗透25～35min，然后室温避光，酶解3.5～4.5h；(3)W5溶液配制：在无菌双蒸水中加入NaCl、CaCl2、KCl和MES缓冲液，混匀得W5溶液；(4)MMG溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、MgCl2和MES缓冲液，混匀得MMG溶液；(5)将步骤(2)酶解完成的簸箕柳叶片与等体积的W5溶液混合，得混合液；(6)对所得混合液进行过滤、离心，吸掉上清液，沉淀部分即为原生质体；(7)加入W5溶液重悬原生质体，冰浴25～35min，原生质体沉淀到底部，吸掉上清，将沉淀重悬于MMG溶液中，得簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。2.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(1)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述KCl的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6，所述第一水浴保温的温度为50～60℃，所述第一水浴保温的时间为4～6min，所述纤维素酶R10的浓度为10～20g/L，所述离析酶R10的浓度为3～5g/L，所述第二水浴保温的温度为50～60℃，所述第二水浴保温的时间为8～12min，所述CaCl2的浓度为8～12mM，所述BSA的浓度为0.05～0.15wt％，所述β
‑
巯基乙醇的浓度为4～6mM，所述过滤的孔径为0.2～0.4mm，所述真空渗透的时间为10～20min。3.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(2)中所述簸箕柳叶片的来源为簸箕柳容器苗或簸箕柳组培苗，所述叶条的宽度为0.5～1mm，所述叶条与酶溶液的用量比为0.5～1.5g:100mL，所述酶解在摇动条件下进行，所述摇动的转速为45～55rpm。4.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(3)中所述NaCl的浓度为150～155mM，所述CaCl2的浓度为120～130mM，所述KCl的浓度为4～6mM，所述MES缓冲液的浓度为1～3mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6；步骤(4)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述MgCl2的浓度为10～20mM，所述MES缓冲液的浓度为3～5mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯静，李梦婷，陈轶群，陈梓馨，薛柯，李淑娴，吴怀通，尹佟明，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：