BTK突变细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞工程技术领域，尤其是涉及BTK突变细胞株及其构建方法，包括如下步骤：S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK

【技术实现步骤摘要】
BTK突变细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，尤其是涉及BTK突变细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]BTK隶属于非受体酪氨酸激酶Tec家族，为膜结合蛋白，是B细胞受体通路的重要信号分子，参与调控B淋巴细胞的发育、分化、活化、增殖及凋亡等过程，在恶性B细胞的生存及扩散中起着重要作用。
[0003]目前临床上常应用的BTK抑制剂主要有伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼、特布替尼(Tirabrutinib)、奥布替尼(Orelabrutinib)等，这些药物在淋巴瘤的治疗中取得了良好疗效。但随着广泛的临床应用，部分患者出现耐药，原发性或继发性的BTK突变是人体产生耐药的重要原因。为了筛选新型抗癌药物，需要建立BTK突变细胞株平台为新型药物筛选提供细胞模型，目前建立BTK突变模型的方法主要有三种：
[0004]一、建立分子动力学模拟模型：该方法主要是依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动，有研究使用BIKI提取了BTK
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SH2
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KD配置，将得到的结构提交给突变研究数据，探测SH2结构域相对于KD的首选3D结构组织，使用SAXS拟合为SH2
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KD配合物，最终完成所有可能的BTK激活分子模型的构建；
[0005]二、体外激酶筛选：该方法可用于直接检测荧光标记的底物和产物间转化比例关系，有研究采用均相时间分辨荧光(HTRF)技术，将具有单磷酸化位点的底物一端接上biotin端，biotin能与streptavidin
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XL665相连，完成底物的标记。底物经过磷酸化之后，便能与抗磷酸化位点结合，从而产生FRET信号，开展体外激酶对化合物的筛选实验；
[0006]三、细胞因子诱导建立细胞模型：该方法是直接或间接增加细胞因子的表达量，使得细胞内BTK表达的变化。如有研究使用多西环素诱导rF10表达，导致细胞大量凋亡，与使用BTK抑制剂作用一致，通过Western Blot进一步检测BTK表达情况，完成细胞模型的构建。
[0007]综合比较上述三种方法，构建的分子动力学模拟模型为计算机模拟对接的产物，仅能进行小分子药物与蛋白结合位点的预测，并不能作为药物筛选的依据；采用体外激酶筛选的方法，容易出现脱靶效应，可能出现假阳性现象；采用细胞因子诱导建立细胞模型的方式，稳定性低、操作复杂，且成本较高，不利于靶向药物的筛选。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种BTK突变细胞株及其构建方法和应用，该方法能够得到稳定的BTK突变耐药株，用于癌症药物的筛选。
[0009]本专利技术的第一方面，提供BTK突变细胞株的构建方法，包括如下步骤：
[0010]S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；
[0011]S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK
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293T细胞；
[0012]S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK
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293细
胞；
[0013]S4、将HEK
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293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；
[0014]S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
[0015]优选的，步骤S1中所述的BTK基因及其突变基因包括：BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M
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E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因；
[0016]所述BTK基因序列如SEQ ID NO：1所示，
[0017]所述T316A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：2所示，
[0018]所述T474S位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：3所示，
[0019]所述T474M位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：4所示，
[0020]所述T474M
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E513G位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：5所示，
[0021]所述C481A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：6所示，
[0022]所述C481Y位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：7所示，
[0023]所述C481F位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：8所示，
[0024]所述C481R位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：9所示。
[0025]进一步的，BTK基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，
[0026]T316A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，
[0027]T474S位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，
[0028]T474M位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，
[0029]T474M
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E513G位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，
[0030]C481A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，
[0031]C481Y位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，
[0032]C481F位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，
[0033]C481R位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
[0034]优选的，步骤S1包括：使用Plvx
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Puro载体质粒，构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒。
[0035]优选的，步骤S2包括：使用Lipo3000将步骤S1获得的重组质粒与PSPAX2质粒、PVSVG质粒转入HEK
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293T细胞。
[0036]优选的，步骤S3包括：48小时后收集步骤S2的病毒上清，用2μm滤器过滤，然后感染HEK
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293细胞8
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12h。
[0037]优选的，步骤S4包括：第二天更换培养液，第三天将HEK
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293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，每隔2～3天更换培养液，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池。
[0038]优选的，所述的抗生素为嘌呤霉素。
[0039]优选的，步骤S5包括：将细胞池消化后接种到96孔板中，继续用嘌呤霉素筛选2
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3周左右，至孔中单克隆长至50％以上汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至24孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK
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293T细胞；S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK
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293细胞；S4、将HEK
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293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。2.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的BTK基因及其突变基因包括：BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M
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E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因；所述BTK基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述T316A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述T474S位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：3所示，所述T474M位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：4所示，所述T474M
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E513G位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：5所示，所述C481A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：6所示，所述C481Y位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：7所示，所述C481F位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：8所示，所述C481R位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：9所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邴铁军，覃艳艳，王爱成，侯琳，黄聪，李英骥，
申请(专利权)人：北京爱思益普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：