一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及免疫细胞培养技术领域，特别涉及一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。该全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。本发明专利技术所构建的体外生发中心模型所使用的饲养层细胞为在疫苗生产领域已广泛使用数十年的人源细胞系MRC5(人胚肺成纤维细胞)，与人B细胞相容性好，并且由于生长速度较慢，不需要使用丝裂霉素C处理或者辐射处理使其增殖停滞，避免了处理过程中残留丝裂霉素C对后续使用带来的影响。本发明专利技术体外生发中心培养模型培养的B细胞可以用于研究B细胞的活化、分化和功能。分化和功能。

【技术实现步骤摘要】
一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及免疫细胞培养
，特别涉及一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人体有3道防线以抵御外界抗原侵袭。第一道防线：物理屏障(我们通常认为皮肤是我们最主要的第一道防线)，病毒、细菌、寄生虫和真菌等抗原等若想对机体造成实质性伤害时需要先突破这道物理屏障；第二道防线：固有免疫系统，固有免疫系统是人体中已经进化了数百万年(相当于先天)的免疫系统，通过识别对机体有害的病原体、细菌等，同时对各类抗原起到快速而强力的清除作用，从而保护人体不受侵袭；第三道防线：适应性免疫系统，这是一种可以适应攻击机体的几乎所有抗原的防御系统，B细胞和T细胞是其重要的成员。
[0003]B淋巴细胞亦可简称B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。如今使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞表面上都存在受体分子，称为B细胞受体(BCRs)。机体的每一种抗体都与一种特殊的抗原结合在一起，因此，为了使抗体能够与许多不同的抗原结合，需要分泌许多不同的抗体分子。在同一个体内，可高达109～10
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，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能。
[0004]体液免疫应答是人体获得性免疫反应的重要环节之一。其中由浆细胞分泌的抗体行使了最主要的功能。初次免疫应答中，浆细胞由成熟的幼稚型B细胞(B cell)分化而成，而这一分化过程的启动则依赖于幼稚型B细胞中BCR信号通路的激活。B细胞通过其表面分布的BCR特异性识别抗原，从而开启B细胞信号通路的活化以及幼稚型B细胞的增殖分化。在经历了体细胞超突变(somatic hypermutation)和免疫球蛋白亚型转换(class switching)后，幼稚型B细胞最终分化成针对抗原高亲和力结合的记忆性B细胞或者具有抗体分泌功能的浆细胞，行使体液免疫功能。
[0005]生发中心(Germinal center)是成熟的幼稚型B细胞(B cell)增殖、分化和提高抗体亲和力的区域。在生发中心，发生很多重要的反应，包括B细胞的克隆增殖、体细胞高频突变、亲和力选择以及浆细胞和记忆细胞的分化，对体液免疫有重要的促进作用。生发中心的研究意义在于：1.生发中心发育的机制尚不明确，并且生发中心是一种瞬时结构，目前人生发中心的研究材料主要来源于医院手术切除的扁桃体，取材困难，因此想要直接获得人体样本来进行研究存在一定困难。而体外生发中心模型的建立在一定程度上解决了取材受限的困境，有助于对B细胞在生发中心中的发育以及异常生发中心进行研究。2.通过体外生发中心模型的建立，在B细胞增殖过程中，可以实现BCR体细胞高频突变(Somatic hypermutation)，从起始量很少的B细胞就获得序列多样化的BCR库，为获得高亲和力的全人源抗体库、研发全人源抗体药物提供基础，同时也可以获得具有一定亲和力的特
异性B细胞用于细胞治疗等研究，以及开发针对肿瘤的预防性疫苗。
[0006]目前，生发中心体外培养技术主要是针对小鼠体外生发中心培养模型，部分针对人体外生发中心模型的建立中所用饲养层细胞也为鼠源细胞(如NIH/3T3)。如：
[0007]1)在小鼠NIH/3T3细胞系(小鼠胚胎成纤维细胞)上构建表达鼠CD40LG和鼠TNFSF13B蛋白的饲养层细胞。通过辐射使细胞失去增殖能力。
[0008]2)从小鼠脾脏中获取 B细胞。
[0009]3)将小鼠 B细胞与饲养层细胞进行共培养，在第一阶段添加IL4因子；在第二阶段添加IL21因子或者持续使用IL4因子。
[0010]4)虽然第二阶段添加的因子不同免疫球蛋白亚型转换(class switching)的方向也不同，但均可以激活B，使其在体外扩增并产生体细胞高频突变变(somatic hypermutation)、免疫球蛋白亚型转换(class switching)。
[0011]又如：
[0012]1)基于小鼠NIH/3T3细胞系构建表达人CD40LG的饲养层细胞。通过辐射或丝裂霉素C使细胞失去增殖能力。
[0013]2)将人PBMC细胞与饲养层细胞共培养，通过加入Cyclosporin A抑制T细胞增殖，但不影响B细胞增殖。
[0014]3)在Day0
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Day14添加IL4因子，可以激活B细胞，使其进行体外扩增。
[0015]但其首要缺点在于从该生发中心模型中获取的B细胞可能会存在含有动物源成份的风险，因此可能会限制从该模型中获取的B细胞的使用(如开发针对肿瘤的治疗性抗体或预防性疫苗)。另外，鼠源饲养层细胞对人B细胞的相容性也存在问题，对B细胞的激活、增殖、分化发育的影响与人体内差异较大。第三，鼠源NIH/3T3细胞生长速度快，使用时需要辐射源照射或药物处理，对成本、安全性均有不良影响。

技术实现思路

[0016]有鉴于此，本专利技术提供了一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。本专利技术建立的一套基于全人源系统的体外生发中心培养模型在一定程度上，更接近人体生发中心。只要在生产过程中采用成份明确的、非动物源成份培养体系，则能完全避免动物源成份。
[0017]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0018]本专利技术提供了一种全人源体外生发中心培养模型，该全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。
[0019]作为优选，人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。
[0020]本专利技术还提供了该全人源体外生发中心培养模型的制备方法，包括如下步骤：
[0021]将人CD40LG和TNFSF13B基因插入慢病毒载体质粒，得到重组质粒；
[0022]将重组质粒转染入HEK293T细胞，进行病毒包装，得到慢病毒；
[0023]将慢病毒转染入人胚肺成纤维细胞，得到含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞；
[0024]将幼稚型B细胞接种于含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，得到全人源体外生发中心培养模型。
[0025]作为优选，病毒载体质粒为pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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copGFP
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T2A
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Puro。
[0026]作为优选，人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。
[0027]本专利技术还提供了一种幼稚型B细胞的增殖分化培养方法，包括如下步骤：
[0028]采用上述含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞，加入B细胞培养基，接种幼稚型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全人源体外生发中心培养模型，其特征在于，所述全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。2.根据权利要求1所述的全人源体外生发中心培养模型，其特征在于，所述人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。3.权利要求1或2所述全人源体外生发中心培养模型的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将人CD40LG和TNFSF13B基因插入慢病毒载体质粒，得到重组质粒；将重组质粒转染入HEK293T细胞，进行病毒包装，得到慢病毒；将慢病毒转染入人胚肺成纤维细胞，得到含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞；将幼稚型B细胞接种于含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，得到全人源体外生发中心培养模型。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体质粒为pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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【专利技术属性】
技术研发人员：王伊，宋海峰，张晶，王丹枫，
申请(专利权)人：谛邈生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：