牛奶外泌体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物大分子提取纯化领域，特别涉及牛奶外泌体及其制备方法。本发明专利技术提出了柠檬酸钠溶解蛋白法，磷酸钠沉淀蛋白法，EDTA沉淀蛋白法和硫酸铵沉淀蛋白法去除酪蛋白，并进行了详细摸索，去除酪蛋白之后后续应用切向流超滤法可实现其他杂蛋白的去除以至10mL到几千升样品的初纯与浓缩，接着利用色谱柱进行精细纯化，可实现牛奶外泌体的大规模制备，并且与超离法和试剂盒法相比产量高，纯度高。纯度高。

【技术实现步骤摘要】
牛奶外泌体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物大分子提取纯化领域，特别涉及牛奶外泌体及其制备方 法。

技术介绍

[0002]1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将 其命名为"exosome"。现今，其特指直径在30
‑
150nm的球状囊泡。多种细胞 在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内 陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
[0003]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今，其 特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中 被发现，1987年Johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状 态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体， 经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
[0004]目前现有的外泌体纯化技术主要有以下几种方法
[0005]1、超速离心法(差速离心)
[0006]超离法是最常用的外泌体纯化手段，是外泌体提取的金标准，但规模较 小，过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到 质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
[0007]2、密度梯度离心
[0008]在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层， 是一种区带分离法。密度梯度离心存在的问题是步骤繁琐，耗时。
[0009]3、超滤离心
[0010]超滤离心法提取外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效 率较低。
[0011]4、磁珠免疫法
[0012]磁珠法提取外泌体效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不 利于下游实验，难以广泛普及。
[0013]5、PEG
‑
base沉淀法
[0014]聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂 蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或 者吐温
‑
20等化学添加物将会破坏外泌体等。
[0015]6、试剂盒提取
[0016]商业化的外泌体提取试剂盒，提取外泌体规模小，并且会产生很多杂蛋 白，外泌体纯度和回收率低。
[0017]以上几种外泌体提取方法都存在操作规模小，外泌体的纯度和回收率低， 难以规模化生产的问题。牛奶外泌体的提取相对于其他外泌体的提取最重要 的在于牛奶样品中酪蛋白的去除。对于牛奶中酪蛋白的去除文献中也有柠檬 酸去除法，磷酸钠沉淀法，EDTA
去除法，用这些方法处理后都是用的超离 法进行后续一步外泌体的提取。

技术实现思路

[0018]有鉴于此，本专利技术提供了牛奶外泌体及其制备方法。该方法能够实现外 泌体的大规模制备，并且操作简单，纯度和回收率高。
[0019]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0020]本专利技术提供了牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
[0021]步骤1、前处理；
[0022]步骤2、初步纯化、浓缩；
[0023]步骤3、精纯；
[0024]所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；
[0025]所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；
[0026]所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto柱纯化、S400分子筛色谱法 纯化中的一种或两者以上的组合。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中去除脂肪包括：
[0028](1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪；和/或
[0029](2)采用离心的方法去除脂肪；
[0030]所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。
[0031]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白 法和/或沉淀蛋白法；
[0032]所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法；
[0033]所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉 淀蛋白法中的一种或两者的组合。
[0034]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与质量浓度为2％～16％的柠檬酸钠溶液混合，冰浴震摇，滤 膜过滤。
[0035]所述柠檬酸钠溶解法具体为：将等体积的牛奶倒入质量浓度为2％～16％ 的柠檬酸钠溶液中，摇床冰浴震摇60min，牛奶样品均变澄清，将澄清的牛奶 样品用0.2μm滤膜进行过滤。
[0036]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与EDTA溶液混合，室温静置，离心，滤膜过滤；所述EDTA 溶液的浓度为0.15M～0.35M，pH值为6.0～7.0。
[0037]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法具体为：取等体 积的牛奶倒入EDTA溶液中，室温沉淀，静置15min，沉淀后的牛奶样品 12000rpm，离心40min，接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤；或 不离心，直接使用囊式滤器进行过滤。
[0038]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M～2.0M， pH值为5.2～8.0。
[0039]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M，pH值 为5.3、6.5或7.6；或
[0040]所述磷酸钠溶液的浓度为1M，pH值为5.2、6.3或pH 7.6；或
[0041]所述磷酸钠溶液的浓度为2.0M，pH值为6.0、pH 7.0或pH 8.0。
[0042]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤：
[0043]不同的牛奶种类，磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同：
[0044](1)全脂牛奶
[0045]取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液 混合，搅拌，沉淀，
‑
80℃冷冻；
[0046](2)脱脂牛奶
[0047]将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，室温静置，于3500rpm 离心10min，收集上清经滤膜过滤。
[0048]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下 步骤：取牛奶16000rpm，离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶倒入磷酸钠 溶液中，磁力搅拌器350rpm，搅拌15min，沉淀后的牛奶样品3500rpm，离 心10min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
[0049]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，25℃～50℃静置，离心，滤膜过滤；所述 硫酸铵溶液的浓度为3.0M～6.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、前处理；步骤2、初步纯化、浓缩；步骤3、精纯；所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto柱纯化、S400分子筛色谱法纯化中的一种或两者以上的组合。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中去除脂肪包括：(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪；和/或(2)采用离心的方法去除脂肪；所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白法和/或沉淀蛋白法；所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法；所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉淀蛋白法中的一种或两者的组合。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤：取等体积的牛奶与质量浓度为2％～16％的柠檬酸钠溶液混合，冰浴震摇，滤膜过滤。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与EDTA溶液混合，25℃
‑
50℃静置，离心，滤膜过滤；所述EDTA溶液的浓度为0.15M～0.35M，pH值为6.0～7.0。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M～2.0M，pH值为5.2～8.0。7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M，pH值为5.3、6.5或7.6；或所述磷酸钠溶液的浓度为1M，pH值为5.2、6.3或pH 7.6；或所述磷酸钠溶液的浓度为2.0M，pH值为6.0、pH 7.0或pH 8.0。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤：不同的牛奶种类，磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同：(1)全脂牛奶取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，
‑
80℃冷冻；(2)脱脂牛奶将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，室温静置，于3500rpm离心10min，收集上清经滤膜过滤。9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，25℃～50℃静置，离心，滤膜过滤；所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M～6.0M。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切向流超滤法采用截留分子量为300KD的中空纤维柱或截留分子量为750KD的中空纤维柱。11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Capto柱纯化采用Core400柱或Core700柱。12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S400分子筛色谱法纯化采用HiPrep 16/60
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S400
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HR柱。13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伊，凌焱，杨晶，董亚南，徐铭枝，周伟，
申请(专利权)人：谛邈生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：