一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种毛囊干细胞分离培养技术，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：S1，分离小鼠毛囊组织；所述小鼠为出生24小时内的小鼠；S2，酶解消化组织；S3，差速贴壁筛选毛囊干细胞；S4，小鼠毛囊干细胞的培养和传代。该方法综合了显微分离技术、酶解法、差速贴壁筛选法，比传统的毛囊干细胞分离方法更适用于小鼠毛囊组织的分离提取，来获取纯度更高、活性更好，干性更强的小鼠毛囊干细胞。干性更强的小鼠毛囊干细胞。

A method for isolation and culture of mouse hair follicle stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法


[0001]本专利技术涉及一种毛囊干细胞分离培养技术，属于生物


技术介绍

[0002]干细胞是一类具备自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在特定条件下，它可能分化成多种功能细胞。干细胞存在于多种组织细胞中，能够通过特定分化和自我更新再生成新的组织。干细胞的特性为许多疾病的治疗提供了新的方向，相对于传统的药物治疗，干细胞的功能更强大，且副作用小，因此在临床医学上有着重要的意义。
[0003]毛囊干细胞就是成体干细胞的一种，位于毛囊外根鞘的隆突区(bulge区)，能分化成表皮、皮脂腺、毛囊等皮肤相关组织的形成细胞。毛囊干细胞的研究为表皮创伤修复、皮肤组织工程、秃发机制研究等，提供了重要的理论依据。除此之外，毛囊干细胞也可以定向诱导成其他组织细胞如泌尿系统组织，相关研究为毛囊干细胞在新的领域奠定了基础。因此获取高质量的毛囊干细胞是一切研究的根本条件。
[0004]目前毛囊干细胞的分离方法主要运用到显微分离法、差速贴壁筛选法、酶解法、免疫磁珠法。显微分离法指的是在体视显微镜下分离出目的组织，差速贴壁筛选法是利用干细胞贴壁快的特点将初分离得到的杂细胞群接种到胶原蛋白包被的培养皿中，通过短时间贴壁来分离干细胞群。酶解法是通过胶原酶或胰酶对消化组织使目的细胞游离出来。而免疫磁珠法则是利用细胞表面抗原能与连接磁珠的特异性抗体相结合的原理，将毛囊干细胞用特异性抗体标记从而分离出来。以上方法通常以2
‑
3种结合的方式用于分离毛囊干细胞。
[0005]常用组织有人或大鼠的毛囊组织。小鼠毛囊组织由于组织面积小，细胞得率低，目前很少被用于提取干细胞。差速贴壁筛选法操作简单，但是得到的细胞纯度相对较低。酶解法消化不当可能会对分离出来的细胞造成损伤。免疫磁珠法操作复杂，成本较高，得到的细胞状态会受到影响。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]S1，分离小鼠毛囊组织；所述小鼠为出生24小时内的小鼠
[0008]S2，酶解消化组织；
[0009]S3，差速贴壁筛选毛囊干细胞；
[0010]S4，小鼠毛囊干细胞的培养和传代；
[0011]其中，所述S1，分离小鼠毛囊组织的方法为：
[0012]S11，剪取小鼠触须皮肤组织，放入组织暂存液，置于冰上；
[0013]S12，酒精洗涤触须皮肤组织，组织清洗液浸泡；
[0014]S13，在体式显微镜下解剖出完整的毛囊组织，加入组织暂存液，置于冰上。
[0015]在一种实施方式中，所述S1，分离小鼠毛囊组织的方法为：
[0016]S11，剪取小鼠触须皮肤组织，放入离心管中，加入组织暂存液，离心管置于冰上；
[0017]S12，触须皮肤组织使用75％酒精漂洗3次，每次30秒，使用组织清洗液再次浸泡3次，每次2
‑
3分钟；
[0018]S13，将触须部组织修剪成0.5cm
×
0.5cm大小，在体式显微镜下剪除上端毛干及毛球部，解剖出完整的毛囊组织，放入离心管中，加入组织暂存液，离心管置于冰上。
[0019]在一种实施方式中，所述小鼠触须部组织包括小鼠触须部位皮肤及皮下组织。
[0020]在一种实施方式中，所述S1，分离小鼠毛囊组织的方法为：
[0021]选择刚出生24小时内的C57小鼠，剪取小鼠触须部位皮肤及皮下组织，放入50ml离心管中，加入组织暂存液，离心管置于冰上；
[0022]触须皮肤组织使用75％酒精漂洗3次，每次30秒，使用组织清洗液再次浸泡3次，每次2
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3分钟；
[0023]将触须部组织修剪成0.5cm
×
0.5cm大小，在体式显微镜下解剖出完整的毛囊组织，剪除上端毛干及毛球部，放入15ml离心管中中，加入组织暂存液，离心管置于冰上。
[0024]所取小鼠必须为24小时内的新生小鼠，此时小鼠组织中的干细胞纯度最高，且毛囊组织洁净度高、分离难度低。
[0025]在一种实施方式中，所述组织暂存液为DMEM基础培养基、5％青链霉素、50μg/ml庆大霉素的混合；所述组织清洗液为PBS、5％青链霉素、50μg/ml庆大霉素的混合。
[0026]配置专用的组织暂存液和组织清洗液，保证组织最低程度的受到外界污染，以及组织内的细胞活力。
[0027]在一种实施方式中，所述S2，酶解消化组织的方法为：
[0028]S21，中性蛋白酶消化；
[0029]S22，胰蛋白酶与乙二胺四乙酸钠消化。
[0030]在一种实施方式中，所述S2，酶解消化组织的方法为：
[0031]S21，中性蛋白酶消化：用DMEM基础培养基漂洗毛囊组织，加入DispaseII溶液，4℃过夜消化，离心后舍弃上清液，用DMEM基础培养基漂洗；
[0032]S22，胰蛋白酶与乙二胺四乙酸钠消化：加入0.125％Trypsin
‑
0.01％EDTA溶液，37℃水浴震荡消化，静置，吸取上清液，置于含DMEM基础培养基+10％FBS离心管中；余下的未消化的毛囊组织重复上次操作，直到移液器吹打，肉眼可见毛囊组织被分解成絮状物,得到细胞混合溶液。
[0033]在一种实施方式中，所述S2，酶解消化组织的方法为：
[0034]1)中性蛋白酶(DispaseII)消化：用DMEM基础培养基漂洗毛囊组织1
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2次，加入5mL浓度为2.5mg/mL的DispaseII溶液，4℃冰箱中过夜消化，2000rpm离心后舍弃上清液，之后用DMEM基础培养基漂洗1次。
[0035]2)胰蛋白酶+乙二胺四乙酸钠消化：加入0.125％Trypsin
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0.01％EDTA溶液5ml，37℃水浴震荡消化10min，静置数秒，未消化的组织块下沉底部，吸取上清液，置于含DMEM基础培养基和10％FBS 50ml离心管中中，余下的未消化的毛囊组织重复上次操作，直到移液器吹打，肉眼可见毛囊组织被分解成絮状物,得到细胞混合溶液。
[0036]为了确保酶对组织的消化不会过度，使用低浓度的中性蛋白酶低温过夜消化，胰酶则使用短时间分批次消化的方式，保证酶解出来的细胞最低程度受到损害。
[0037]在一种实施方式中，所述S3，差速贴壁筛选毛囊干细胞的方法为：
[0038]S31，过滤组织块、洗涤所述细胞混合溶液；
[0039]S32，用Ⅳ型胶原蛋白包被细胞培养皿，将洗涤后的细胞混合液用K
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FSM无血清培养基重悬后接种于所述包被细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，2h后更换为培养基为含10％FBS的K
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FSM培养基，得到P0代细胞。
[0040]在一种实施方式中，所述S31，具体为收集的细胞混合溶液过200目筛网本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1，分离小鼠毛囊组织；所述小鼠为出生24小时内的小鼠S2，酶解消化组织；S3，差速贴壁筛选毛囊干细胞；S4，小鼠毛囊干细胞的培养和传代；其中，所述S1，分离小鼠毛囊组织的方法为：S11，剪取小鼠触须皮肤组织，放入组织暂存液，置于冰上；S12，酒精洗涤触须皮肤组织，组织清洗液浸泡；S13，在体式显微镜下解剖出完整的毛囊组织，加入组织暂存液，置于冰上。2.根据权利要求1所述的一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述S1，分离小鼠毛囊组织的方法为：S11，剪取小鼠触须皮肤组织，放入离心管中，加入组织暂存液，离心管置于冰上；S12，触须皮肤组织使用75％酒精漂洗3次，每次30秒，使用组织清洗液再次浸泡3次，每次2
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3分钟；S13，将触须部组织修剪成0.5cm
×
0.5cm大小，在体式显微镜下剪除上端毛干及毛球部，解剖出完整的毛囊组织，放入离心管中，加入组织暂存液，离心管置于冰上。3.根据权利要求1或2所述的一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述组织暂存液为DMEM基础培养基、5％青链霉素、50μg/ml庆大霉素的混合；所述组织清洗液为PBS、5％青链霉素、50μg/ml庆大霉素的混合。4.根据权利要求1所述的一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述S2，酶解消化组织的方法为：S21，中性蛋白酶消化；S22，胰蛋白酶与乙二胺四乙酸钠消化。5.根据权利要求1或4所述的一种小鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述S2，酶解消化组织的方法为：S21，中性蛋白酶消化：用DMEM基础培养基漂洗毛囊组织，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡清云，刘彩云，
申请(专利权)人：湖南丰晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：