将猴源NOVA1基因特异性地修改为人源基因的方法技术

本发明专利技术属于基因工程和基因遗传修饰领域，提供了一种将猴源NOVA1基因修改为人源基因的方法，包括：确定猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点和所述sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；合成含所述的sgRNA的U6

【技术实现步骤摘要】
将猴源NOVA1基因特异性地修改为人源基因的方法


[0001]本专利技术属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种通过单碱基编辑技术将猴源NOVA1基因特异性地修改为人源基因的载体的制备方法。

技术介绍

[0002]人类进化通常被认为是一种长期持续的行为，由于基因突变和自然选择，人类进化仍在继续。基因突变在人类中是偶然发生的，因为父母会将携带某些特定性状的基因遗传给后代。这些基因传递可能通过自然选择而发生，优势基因的携带者能够更好地生存、适应环境以及繁殖后代。
[0003]尼安德特人是现代欧洲人祖先的近亲，从12万年前开始，他们统治着整个欧洲、亚洲西部以及非洲北部，但在两万四千年前，这些古人类却消失了。2021年Muotri团队通过分析来自现代人类与尼安德特人的基因组之间的差异，找到了61个不同的基因，其中NOVA1是主要的基因调节器，能影响大脑发育过程中其他基因的剪接。在生物进化过程中，编码NOVA1基因200号位点氨基酸的碱基逐渐发生基因突变，由ATA编码的异亮氨酸突变改变为由GTA编码的缬氨酸。Muotri团队使用CRISPR基因编辑技术，对现代人类的干细胞进行了编辑，引入了尼安德特人NOVA1基因中的变异，模拟了"尼安德特人化"的大脑器官体。发现现代人和尼安德特人化的大脑在发育过程中的一些差异。如果能将相对低版本的且目前仍存在的生物，尤其是与人类进化程度接近的灵长类生物，如猴、猩猩等的NOVA1版本修改为人源版本，对于研究生物进化将具有重要的参考意义。然而，这部分工作目前未见报道。
[0004]基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。CRISPR/Cas9基因编辑系统虽然提高了基因敲除及定点修饰(包括定点突变及基因插入等)的效率，但是基于同源重组机制的基因定点突变效率仍然偏低。为了提高定点突变的效率，一项结合CRISPR/Cas9和胞嘧啶脱氨酶的单碱基编辑系统被相继报道。单碱基编辑技术能够在不产生双链断裂的前提下，对DNA的单个碱基进行替换，因而具有高效而又精确的基因编辑能力，可在动植物细胞内引入点突变，用于培育具有理想表型的基因编辑动植物，也可以对致病性点突变进行纠正，从而用于遗传疾病的基因治疗。其中，腺嘌呤单碱基编辑器(简称ABE)，可以对目标位点实现高效腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的单碱基转换，能够有效的将ATA版本的猴源基因组修改为GTA版本的人源基因组。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的方法，对猴源基因组NOVA1基因进行单点定向改造。
[0006]在2021年《science》研究论文中，Muotri团队使用CRISPR基因编辑技术，对现代人类的干细胞进行了编辑，引入了尼安德特人NOVA1基因中的变异，模拟了"尼安德特人化"的大脑器官体。而本专利反其道而行之，在猴源细胞cos7中(尼安德特人的细胞不可能获得，
而cos7是猴源的常用工具细胞，是用于猴源细胞实验的模型细胞)进行基因编辑，将猴源基因模板修改为人源基因模板，为后续猴，猩猩、古人类等进化为现代人类研究提供了一种技术可能的模型。最有效，最直接的方式是在猴子动物上直接修改基因，获得人员版本的猴子，在动物个体上进行大脑发育的研究。但是，本专利技术没有这种实验条件开展此类实验。
[0007]本专利技术提出一种通过单碱基编辑技术将含有猴源NOVA1基因的载体特异性地修改为人源基因的载体的制备方法。单碱基编辑技术能够在不产生双链断裂的前提下，高效的引入点突变，但是并非所有的基因突变都能够使用单碱基编辑技术，也不是所有的同源基因改变都能够使用单碱基编辑技术实现。本专利技术的研究发现，猴源NOVA1基因的200号氨基酸(ATA)中的第一个A碱基完美符合单碱基编辑的要求，不仅最合适的单碱基编辑窗口，而且单碱基的改变能够产生显著的表型。本专利技术在综合考虑单碱基编辑技术在科学逻辑上的可行性及临床研究的价值的基础上，能够通过单碱基编辑技术，将猴源细胞中的NOVA1的200号位点的异亮氨酸修改为由GTA编码的缬氨酸，并且获得特异而稳定的定点突变材料。
[0008]一方面，本专利技术提出一种将猴源NOVA1基因修改为人源基因的方法，包括以下步骤：
[0009]确定猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点和所述sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]合成含所述的sgRNA的U6
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sgRNA
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scafold的联合序列，扩增含嘌呤霉素的片段，并构建到原始载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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SpRY
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P2A
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EGFP(RTW5025)上，成为最终载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1。
[0011]优选地，所述的方法包括：在将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞中前，复苏、培养猴源细胞cos7。
[0012]优选地，通过筛选猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点及sgRNA，确定猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点和所述sgRNA。
[0013]优选地，在将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞中后，鉴定或者确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列。
[0014]优选地，鉴定或者确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列是指，将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞或者293T细胞中，通过嘌呤霉素筛选及基因组鉴定，确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列。
[0015]优选地，所述的联合序列如SEQ ID NO.2所示，扩增片段的序列如SEQ ID NO.3所示，原始载体的序列如SEQ ID NO.4所示，最终载体的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]第二方面，本专利技术还提供了上述方法的应用，包括使用所述的方法将猴源NOVA1基因修改为人源基因。
[0017]根据本专利技术的一些实施例，所述将猴源NOVA1基因特异性地修改为功能性人源基因是基于单碱基编辑技术实现的。本专利技术使用单碱基编辑技术，在不需要切割基因组的基础上实现了对NOVA1基因200号氨基酸的定点突变，为以后针对NOVA1基因特定位点的研究提供了一种具有可能性的技术手段和临床思路。因此，本专利技术在创新性和实用性上都具有一定的科研价值和实际意义。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将猴源NOVA1基因修改为人源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：确定猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点和所述sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；合成含所述的sgRNA的U6
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sgRNA
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scafold的联合序列，扩增含嘌呤霉素的片段，并构建到原始载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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SpRY
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P2A
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EGFP(RTW5025)上，成为最终载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：在将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞中前，复苏、培养猴源细胞cos7；通过筛选猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点及sgRNA，确定猴源细胞NOVA1基因组修改为人源基因的特异性位点和所述sgRNA；或者在将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞中后，鉴定或者确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，鉴定或者确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列是指，将构建的pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1转染到cos7细胞或者293T细胞中，通过嘌呤霉素筛选及基因组鉴定，确认构建的最终载体能将猴源基因组NOVA1特异性位点修改为人源特异性序列。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的联合序列如SEQ ID NO.2所示；扩增片段的序列如SEQ ID NO.3所示；原始载体的序列如SEQ ID NO.4所示；或者最终载体的序列如SEQ ID NO.5所示。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的合成含所述的sgRNA的U6
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sgRNA
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scafold的联合序列，扩增含嘌呤霉素的片段，并构建到原始载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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SpRY
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P2A
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EGFP上，成为最终载体pCMV
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T7
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ABEmax(7.10)
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NOVA1的步骤包括：S2
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【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明贵，刘彩云，
申请(专利权)人：湖南丰晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：