一种T细胞基因编辑的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种对分离的T细胞进行基因编辑的方法，所述方法由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒作为载体将靶向T细胞目的基因的Cas9/sgRNA转入T细胞，通过基因编辑使T细胞目的基因失活。本发明专利技术还提供了所述方法制备的CD7和PD1缺陷的T细胞在制备嵌合抗原受体T细胞中的应用。本发明专利技术提供的方法简单、绿色、成本低、生物相容性好、细胞毒性低。具有高效的细胞摄入率和基因编辑率，还可以实现对基因编辑系统的定量控制，降低脱靶效应，在基因编辑和治疗领域具有广阔的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种T细胞基因编辑的方法及应用


[0001]本专利技术公开了一种T细胞的基因编辑方法，属于细胞工程


技术介绍

[0002]对于CRISPR基因编辑应用来说，向细胞直接递送Cas9蛋白和sgRNA形成的复合物可以实现更高的特异性和安全性。然而，递送Cas9/sgRNA复合物的难度较大。首先，Cas9蛋白和sgRNA易受胞内酶降解而失活；其次，将Cas9/sgRNA组装成能被细胞摄取的紧密、稳定结构的同时，需要考虑Cas9/sgRNA在细胞内的解离和释放，Cas9/sgRNA与载体结合过于紧密也会降低其活性。而目前已有的Cas9/sgRNA递送载体通常存在合成路线复杂、基因编辑效率低、载体材料不充分降解导致的细胞毒性等问题。并且对于原代T细胞这类结构特殊、尺寸较小的悬浮细胞，没有载体被报道过能够进行Cas9/sgRNA递送产生基因编辑T细胞，而电转对细胞的损伤较大且依赖于特定的设备。
[0003]嵌合抗原受体T细胞（CAR T）是目前治疗恶性肿瘤最有效的方式之一。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。由于T细胞的一些内源基因会导致免疫排斥反应从而限制CAR T免疫效果，基因编辑技术联合CAR T在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。使用基因编辑改造过的T细胞作为CAR T细胞来源，有潜力加强CAR T治疗癌症和感染性疾病的疗效。
[0004]CD7和PD1是与CAR T相关的两个具有明确临床治疗意义的靶点。CD7是一种在T细胞恶性肿瘤中高度表达的跨膜蛋白，可作为治疗T细胞恶性肿瘤的CAR分子靶抗原。由于正常T细胞也会表达CD7，CD7特异性CAR分子的表达会导致T细胞自相残杀，从而阻碍CAR T细胞的体外扩增。敲除正常T细胞上的CD7基因能够阻止这种自相残杀，提高治疗效果。PD1是T细胞上表达的一种调节免疫激活程度的免疫抑制分子，参与抑制外周组织中持续的免疫应答，并阻止自身组织免疫损伤，对人体免疫系统中起保护作用。由于肿瘤细胞表面通常会高表达PD
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L1（程序性死亡配体1），T细胞上的免疫检查点分子PD1和肿瘤细胞上的PD
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L1结合会启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。敲除T细胞上的PD1基因能够减弱免疫抑制信号，增强CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
[0005]Cas9/sgRNA在T细胞上的现有递送技术只有电转方式的报道，因此使用可降解纳米颗粒实现对T细胞CD7 和PD1的基因编辑以解决上述限制的递送系统对于促进CRISPR基因编辑系统向临床上应用和发展尤其是对T细胞的基因编辑的应用成为本领域的技术需要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种对分离的T细胞进行基因编辑的方法，所述方法包括：（1）构建由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒，所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后，与电中性单体和阳离子单体
在自由基引发剂存在下原位聚合形成；（2）以步骤（1）获得的纳米颗粒为载体，与靶向T细胞目的基因的Cas9/sgRNA混合，获得所述纳米颗粒与所述Cas9/sgRNA复合物混合形成的自组装复合物；（3）将步骤（2）获得的自组装复合物转入分离的T细胞。
[0007]在一个优选的实施方案中，步骤（1）所述阳离子单体为2
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(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，所述电中性单体为丙烯酰胺，所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺，所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰化修饰。
[0008]在一个更为优选的实施方案中，使用N
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羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行所述的蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰。
[0009]更为优选地，所述蛋白质为具有两个以上赖氨酸残基的任意多肽。
[0010]又为优选地，所述蛋白质为牛血清白蛋白。如本领域技术人员所周知的，只要修饰不干扰纳米颗粒的合成，化学修饰（如荧光分子标记）的多肽也被包括在本专利技术的实施方案之中。
[0011]尤为优选地，所述牛血清白蛋白：丙烯酰胺：2
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(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯：过硫酸铵：四甲基乙二胺的摩尔比为1：3000：3000：250：1000。
[0012]在一个优选的实施方案中，步骤（2）所述Cas9/sgRNA中sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述T细胞目的基因为编码CD7的基因。
[0013]在另一个优选的实施方案中，步骤（2）所述Cas9/sgRNA中sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述T细胞目的基因为编码PD1的基因。
[0014]其次，本专利技术提供了一种根据上述方法制备的CD7缺陷的T细胞。
[0015]第三，本专利技术提供了一种根据上述方法制备的PD1缺陷的T细胞。
[0016]第四，本专利技术提供了上述CD7缺陷的T细胞和/或PD1缺陷的T细胞在制备嵌合抗原受体T细胞中的应用。
[0017]最后，本专利技术提供了上述的T细胞在制备肿瘤治疗或者自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
[0018]同现有的T细胞基因编辑方法相比较，本专利技术所述的以可降解纳米颗粒为Cas9/sgRNA载体的方法具有以下突出优势：1）本专利技术提供的Cas9/sgRNA载体利用蛋白质原位聚合高分子，材料制备方法简单、绿色、成本低；以蛋白为内核的设计思路使得材料的生物相容性好，细胞毒性低。
[0019]2）本专利技术所述的纳米颗粒只需要通过简单的混合，即可以很好的负载Cas9/sgRNA复合物，在不需要任何其他转染试剂的情况下，可以高效地将Cas9/sgRNA递送至细胞内，显著提高细胞摄入率。
[0020]3）本专利技术纳米颗粒的高分子外壳的阳离子单体设计为具有叔胺基和酯键的2
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(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，叔胺基结构产生质子海绵效应有助于内体逃逸，连接叔胺基的酯键在生理温度下发生水解反应使阳离子基团降解，促进了Cas9/sgRNA从自组装复合物上的释放。同时，胞质中的组分如带负电蛋白和氨基酸对纳米颗粒与Cas9/sgRNA的结合位点产生竞争，进一步加速了胞质中Cas9/sgRNA从自组装复合物上的解离。本专利技术所述的纳米颗粒可实现高水平的Cas9/sgRNA释放，显著提高基因编辑效果。
[0021]4）在T细胞基因编辑的应用中，所述纳米颗粒介导的Cas9/sgRNA复合物在细胞内
对目的基因的编辑效率可达到14%。同时，直接递呈Cas9/sgRNA复合物的方法有利于实现对其胞内含量和作用时间的定量调控，降低脱靶效应。
[0022]5）除了电转，现有的Cas9/sgRNA递送系统都不能用于原代T细胞等难转染的细胞类型。基于可降解纳米颗粒的Cas9/sgRNA递送系统为原代T细胞提供了一种新的基因敲除方法，为下一代免疫治疗如通用型CAR T细胞的制备奠定了基础。
附图说明
[0023]图1为纳米颗粒及其Cas9/sgRN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对分离的T细胞进行基因编辑的方法，所述方法包括：（1）构建由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒，所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后，与电中性单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成；（2）以步骤（1）获得的纳米颗粒为载体，与靶向T细胞目的基因的Cas9/sgRNA混合，获得所述纳米颗粒与所述Cas9/sgRNA复合物混合形成的自组装复合物；（3）将步骤（2）获得的自组装复合物转入分离的T细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述阳离子单体为2
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(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，所述电中性单体为丙烯酰胺，所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺，所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰化修饰。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用N
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羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行所述的蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白质为具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡暄，陈薇，张晓鹏，邹金桃，卢醒，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：