ALS疾病模型犬的建立方法技术

本发明专利技术涉及通过转基因技术制备肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的方法，具体提供了利用转基因技术制备hSOD1

【技术实现步骤摘要】
ALS疾病模型犬的建立方法


[0001]本专利技术涉及利用转基因技术制备肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的方法，尤其是涉及利用转基因技术制备hSOD1
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G93A转基因的ALS疾病模型犬的方法。

技术介绍

[0002]肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种破坏性的运动神经元疾病，主要由脊髓中异常积聚的包涵体引起。ALS患者在发病3至5年后会出现广泛的肌肉萎缩和萎缩，导致瘫痪和死亡。这种情况可能是家族性的(fALS 10％)或散发性的(salALS 90％)。绝大多数的fALS病例是由于超氧化物歧化酶1基因(SOD1)的基因突变和编码C9ORF72基因的重复核苷酸扩增。
[0003]超氧化物歧化酶1(SOD1)编码胞质Cu/Zn超氧化物歧化酶，其显性突变已被确定为家族性ALS的主要遗传原因之一。已知SOD1突变蛋白以不溶性包裹体的形式在SOD1相关的ALS患者的受影响脊髓运动神经元(MNs)内异常积累。
[0004]动物模型是研究肌萎缩性脊髓侧索硬化症病理机制和筛选相关药物的重要手段，但已有动物模型存在诸多限制。到目前为止，已经构建了超过10个啮齿类动物模型，其中大部分是小鼠，通过过表达人类突变体SOD1实现，这些小鼠的脊髓运动神经元选择性丧失，导致后肢和前肢广泛的肌肉萎缩和萎缩，最终导致瘫痪和死亡。小鼠模型的一个缺陷是皮质运动神经元退行性变(皮质运动神经元退行性变是ALS诊断所必需的人类疾病的基本特征)在大多数模型中并不常见。渐冻症转基因猪模型(人SOD1(hSOD1)(G93A)转基因猪)的后肢运动障碍与运动神经元死亡有关，并伴有星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生，以及骨骼肌萎缩。hSOD1转基因猪表现出人类渐冻症的典型疾病特征，以及在其他渐冻症动物模型中未见的独特核内含物。研究发现，SOD1与PCBP1(一种核多聚(rC)结合蛋白)在猪脑中结合，但在小鼠脑中没有，这表明SOD1
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PCBP1相互作用解释了SOD1的核积累，并且物种特异性靶点是大型哺乳动物和人类ALS病理的关键。非人灵长类是用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症研究的理想建模动物，但该模型也存在一定局限性，如开发技术难度高、繁殖速度慢等。同时，非人灵长类动物的个体差异显著、动物伦理和动物保护等问题制约了该类模型的广泛应用，且目前没有可供该基因研究的非人灵长类动物模型。
[0005]犬退行性脊髓病(DM)临床表现类似于ALS患者的原发性外侧硬化。犬退行性脊髓病发病没有明显的性偏好。DM是指老年犬胸腰段脊髓前部和外侧索弥漫性轴索坏死，继发脱髓鞘和星形胶质增生。SOD1基因突变的纯合子狗有患退行性脊髓病的风险，对犬只进行SOD1基因检测通常用于降低退行性脊髓病发病率。DM和ALS都导致内质网应激标志物GRP78/BiP表达上调。尽管针对ALS患者的新疗法的临床试验显示出了有希望的结果，但鉴于在病理生理学上的显著重叠，尤其是SOD1基因在两种疾病中的共同重要性，在患有DM的狗身上测试新疗法仍是有用的，将其作为ALS的动物模型。
[0006]因此，需要一种适当的动物模型用于更好地模拟SOD1基因相关ALS疾病，以用于临床转化及相关药物的开发研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种通过PB转座酶系统建立hSOD1
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G93A转基因的ALS疾病模型的方法。本专利技术还涉及所建立的ALS疾病模型犬及其细胞和组织。
[0008]在第一方面，本专利技术提供了一种肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的建立方法，所述方法包括利用转基因技术获得hSOD1
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G93A转基因的犬受精卵或犬体细胞。
[0009]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)根据hSOD1基因的CDS区设计扩增引物，并进行PCR扩增获得hSOD1基因的CDS片段；
[0011](2)对步骤(1)得到的hSOD1基因的CDS片段进行酶切，获得酶切产物，将获得的酶切产物与线性化的骨架载体连接构建hSOD1重组质粒；
[0012](3)根据hSOD1重组质粒设计hSOD1
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G93A突变的扩增引物，通过扩增制备hSOD1
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G93A重组质粒；
[0013](4)将hSOD1
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G93A重组质粒和转座酶表达质粒共同导入犬受精卵或犬体细胞中，获得hSOD1
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G93A犬受精卵或犬体细胞。
[0014]在一些实施方式中，步骤(1)中，所述扩增引物包括：
[0015]正向引物：CGGCTAGCatggcgacgaaggccgtgt(SEQ ID NO：2)；
[0016]反向引物：TTGCGGCCGCttattgggcgatcccaattacac(SEQ ID NO：3)。
[0017]在一些实施方式中，步骤(2)中，所述骨架载体选自PiggyBac Dual promoter(PB513B
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1)载体。
[0018]在一些实施方式中，步骤(3)中，所述hSOD1
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G93A突变的扩增引物包括：
[0019]正向引物：GACTGCTGACAAAGATGCTGTGGCCGATGTGTCTATT(SEQ ID NO：4)；
[0020]反向引物：AATAGACACATCGGCCACAGCATCTTTGTCAGCAGTC(SEQ ID NO：5)。
[0021]在一些实施方式中，步骤(3)中，通过环形聚合酶延伸法方式制备hSOD1
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G93A重组质粒。
[0022]在一些实施方式中，步骤(3)中，所述转座酶表达质粒选自Super PiggyBac Transposase转座酶表达质粒。
[0023]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的hSOD1
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G93A犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备ALS疾病模型犬。
[0024]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的hSOD1
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G93A犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备ALS疾病模型犬。
[0025]在一些实施方式中，转基因犬制备方式包括受精卵胞质注射方式，还可包括体细胞克隆方式制备，其中克隆用的基因编辑靶细胞除犬胚胎成纤维细胞外，还可使用上皮细胞、干细胞等其他犬源体细胞。
[0026]在第二方面，本专利技术提供了由第一方面的方法获得的ALS疾病模型犬的体细胞、组织和器官。
[0027]在一些实施方式中，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：6所示的序列。
[0028]在第三方面，本专利技术提供了一种引物对组合物，所述引物对的序列如下：
[0029]正向引物F：ATGTCGTAACAACTCCGCCCCA(SEQ ID NO：7)；
[0030]反向引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的建立方法，所述方法包括利用转基因技术获得hSOD1
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G93A转基因的犬受精卵或犬体细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据hSOD1基因的CDS区设计扩增引物，并进行PCR扩增获得hSOD1基因的CDS片段；(2)对步骤(1)得到的hSOD1基因的CDS片段进行酶切，获得酶切产物，将获得的酶切产物与线性化的骨架载体连接构建hSOD1重组质粒；(3)根据hSOD1重组质粒设计hSOD1
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G93A突变的扩增引物，通过扩增制备hSOD1
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G93A重组质粒；(4)将hSOD1
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G93A重组质粒和转座酶表达质粒共同导入犬受精卵或犬体细胞中，获得hSOD1
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G93A犬受精卵或犬体细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩增引物包括：正向引物：CGGCTAGCatggcgacgaaggccgtgt(SEQ ID NO：2)；反向引物：TTGCGGCCGCttattgggcgatcccaattacac(SEQ ID NO：3)。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述骨架载体选自PiggyBac Dual promoter(PB513B
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1)载体。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述hSOD1
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G93A突变的扩增引物包括：正向引物：GACTGCTGACAAAGATGCTGTGGCCGATGTGTCTATT(SEQ ID NO：4)；反向引物：AATAGACACATCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：米继东，赵建平，贾怡昌，郭炜，齐辉辉，彭林，
申请(专利权)人：神济昌华北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：