一种将目的基因定点整合至免疫细胞特定位点的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种将目的基因定点整合至免疫细胞特定位点的方法及其应用，特别是一种基于非病毒载体将目的基因(例如CAR基因)定点整合至免疫细胞特定位点(例如HPK1)的方法及其应用。该方法可以精准将目的基因(如CAR基因)定点整合至免疫细胞特定位点(例如HPK1)，实现将基因敲除和目的基因导入一步完成，制备特定位点基因敲除且稳定表达目的基因的细胞。该方法具有制备简单、成本低、表达稳定、功能稳定、不影响细胞基因特性的特征。所得细胞具有杀伤效率高、浸润能力强等特征。浸润能力强等特征。浸润能力强等特征。

【技术实现步骤摘要】
一种将目的基因定点整合至免疫细胞特定位点的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种基于非病毒载体将目的基因(例如CAR基因)定点整合至免疫细胞特定位点(例如HPK1)的方法及其应用。

技术介绍

[0002]基因治疗(gene therapy)是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：恶性肿瘤、遗传病(如血友病、先天性黑朦、囊性纤维病)、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病等)和自身免疫疾病(如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病等)等。
[0003]肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，近年来针对肿瘤的免疫疗法逐渐成为肿瘤治疗的研究热点。肿瘤免疫细胞疗法是对从人体内采集的免疫细胞进行体外修饰、培养和扩增，再回输到病人体内激发和增强机体自身免疫功能，从而达到抑制肿瘤生长、杀伤肿瘤细胞的效果。
[0004]嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T细胞)免疫疗法在血液学肿瘤治疗方面取得了显著的成功，携带CAR的T细胞可直接识别目的抗原，而不在乎抗原是否呈递在MHC上，从而避免了“MHC限制性”。在体内收到目的抗原刺激时可诱发一系列细胞免疫反应，最终杀灭靶细胞。传统的CAR
‑
T疗法是利用基因工程技术，通过病毒载体的形式将CAR转入T细胞，这种策略往往需要用到慢病毒等病毒载体进行感染。一方面病毒载体生产成本很高、工艺相对复杂，另一方面会带来随机插入的安全隐患，例如，存在插入点突变和诱导细胞发生转化甚至致癌的风险。
[0005]基于此，现有技术中公开了一些定点整合技术，例如，专利申请CN105524943A中公开了一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVS1位点的方法，专利申请CN111944848A中公开了一种基于电转技术和CRISPER
‑
Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法。专利申请CN113005092A公开了一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR
‑
T细胞的制备，采用靶向LMP1的CAR
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T细胞联合敲除PD1的联合治疗。但现有技术的方法往往存在着方法步骤复杂、CAR转导效率低等缺陷。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种基于非病毒载体将目的基因(例如CAR基因)定点整合至免疫细胞特定位点(例如HPK1)的方法，其可实现将特定基因位点敲除和目的基因导入一步完成，简化了工艺流程，降低了生产成本，缩短了制备时间。
[0007]在本专利技术第一方面，提供一种将目的基因定点整合至免疫细胞特定位点的方法，其包括如下步骤：
[0008]S1，构建同源重组修复模板载体；
[0009]S2，将基因编辑系统、步骤S1所得载体共同引入免疫细胞中；
[0010]任选地，S3，将步骤S2所得免疫细胞进行培养和鉴定。
[0011]其中，步骤S1中的载体选自：腺相关病毒(AAV)、微环DNA(minicircle DNA，mcDNA)、双链DNA(double
‑
stranded DNA，dsDNA)或单链DNA(single
‑
stranded DNA，ssDNA)，特别是微环DNA。
[0012]具体地，步骤S1中的同源重组修复模板包含同源臂和目的基因，更具体地，同源重组修复模板从5
’
到3
’
依次包含：靶序列(TSF)、左端同源臂(LHA)、启动子、目的基因、polyA、右端同源臂(RHA)、靶序列(TSF)。
[0013]具体地，目的基因可以为CAR基因；更具体地，CAR识别的靶标可以为：RORl、Her2、Ll
‑
CAM、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、叶酸受体抗体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD276、CD44、EGFR、EGP
‑
2、EGP
‑
4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW
‑
MAA、IL
‑
22R
‑
α、IL
‑
13R
‑
α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞粘附分子(CD171)、MAGE
‑
A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY
‑
ESO
‑
1、MART
‑
1、gp100、瘤胎抗原、TAG72、VEGF
‑
R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原、PSMA、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD123、CS
‑
1、c
‑
Met、GD
‑
2、MAGEA3、CE7、Wilms肿瘤1(WT
‑
1)、细胞周期蛋白A1(CCNA1)、BCMA和白介素12；在本专利技术的一些实施例中，CAR识别的靶标为CD19，即CD19 CAR。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，CAR基因包含如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，特别是，由其组成。
[0015]具体地，特定位点可以为HPK1、PD
‑
1、TRAC，特别是HPK1，特别是HPK1 EXON。
[0016]具体地，TSF包含如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，或，TSF的序列如SEQ ID NO：16所示。
[0017]具体地，左端同源臂和右端同源臂的长度分别为200
‑
1000bp(例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000bp)；在本专利技术的一个实施例中，左端同源臂和右端同源臂分别包含如SEQ ID NO：9和10所示的核苷酸序列，或分别如SEQ ID NO：9和10所示；在本专利技术另一实施例中，左端同源臂和右端同源臂分别包含如SEQ ID NO：11和12所示的核苷酸序列，或分别如SEQ ID NO：11和12所示；在本专利技术另一实施例中，左端同源臂和右端同源臂分别包含如SEQ ID NO：13和14所示的核苷酸序列，或分别如SEQ ID NO：13和14所示。
[0018]具体地，启动子可以为EF1αpromoter，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
[0019]具体地，polyA可以为BGHpA、SV40 polyA或WPRE，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6
‑
8所示；在本专利技术的一个实施例中，polyA为SV40polyA。
[0020]具体地，步骤S2中的基因编辑系统为降低特定位点(例如HPK1)在免疫细胞中表达的基因编辑系统，其可以为CRISPR系统、ZFN、TALEN等，特别是CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将目的基因定点整合至免疫细胞特定位点的方法，其包括如下步骤：S1，构建同源重组修复模板载体；S2，将基因编辑系统、步骤S1所得载体共同引入免疫细胞中；任选地，S3，将步骤S2所得免疫细胞进行培养和鉴定。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定位点为HPK1、PD
‑
1、TRAC；优选地，所述特定位点为HPK1，特别是HPK1 EXON。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述载体选自：腺相关病毒、微环DNA、双链DNA或单链DNA；优选地，所述载体为微环DNA。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述同源重组修复模板从5
’
到3
’
依次包含：靶序列(TSF)、左端同源臂(LHA)、启动子、目的基因、polyA、右端同源臂(RHA)、靶序列(TSF)。5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述目的基因为CAR基因；优选地，所述CAR识别的靶标选自：RORl、Her2、Ll
‑
CAM、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、叶酸受体抗体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD276、CD44、EGFR、EGP
‑
2、EGP
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4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW
‑
MAA、IL
‑
22R
‑
α、IL
‑
13R
‑
α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞粘附分子(CD171)、MAGE
‑
A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY
‑
ESO
‑
1、MART
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1、gp100、瘤胎抗原、TAG72、VEGF
‑
R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原、PSMA、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD123、CS
‑
1、c
‑
Met、GD
‑
2、MAGEA3、CE7、Wilms肿瘤1(WT
‑
1)、细胞周期蛋白A1(CCNA1)、BCMA和白介素12或其组合；更优选地，所述CAR基因包含如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，TSF包含如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述左端同源臂和右端同源臂的长度分别为200
‑
1000bp；优选地，所述左端同源臂和右端同源臂分别包含如SEQ ID NO：9和10所示的核苷酸序列，或分别如SEQ ID NO：9和10所示；或，所述左端同源臂和右端同源臂分别包含如SEQ ID NO：11和12所示的核苷酸序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，李赛，张丽琴，
申请(专利权)人：西安宇繁生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：