PDHB基因在抗镰刀菌酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了PDHB基因在抗镰刀菌酸中的应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术要求保护敲除或抑制PDHB基因表达的试剂在制备提高生物体对镰刀菌酸的耐受性的产品中的应用。本发明专利技术还要求保护一种抗镰刀菌酸的产品，包括敲除或抑制PDHB基因表达的试剂。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，建立目的基因敲除的IPEC

【技术实现步骤摘要】
PDHB基因在抗镰刀菌酸中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及PDHB基因在抗镰刀菌酸中的应用。

技术介绍

[0002]镰刀菌酸(FA)是镰刀菌侵染植物产生的代谢产物之一，可引起番茄、棉花、西瓜、黄瓜和香蕉等植物的枯萎病，也普遍存在于玉米、小麦、大麦和其他谷物中。作为动物饲料中常见的真菌毒素之一，各种类型饲料均存在不同程度的镰刀菌酸污染。受污染的猪饲料中普遍含有镰刀菌酸，而在重度污染的肥育日粮含有更高浓度的镰刀菌酸。此外，在奶牛TMR日粮和青贮饲料中也检测到了不同浓度镰刀菌酸。
[0003]镰刀菌酸对于猪生产业存在隐患，摄入镰刀菌酸会对猪的采食量和机体健康产生影响并引发各种症状。母猪和仔猪对真菌毒素尤为敏感，食用被镰刀菌酸污染的饲料会引起母猪繁殖性能下降，分娩的仔猪免疫球蛋白浓度显著降低。摄入含镰刀菌酸的饲料对1周龄仔猪有免疫抑制作用，表现为胸腺皮质与髓质的比值显著降低、凋亡和增殖细胞显著增加。在受污染的日粮中，镰刀菌酸和呕吐毒素共存且浓度较低的情况下，猪的采食量显著减少，体重在三周后出现下降，当母猪和仔猪摄入含高浓度镰刀菌酸和呕吐毒素的饲料时，会发生毒素的协同效应，增强混合物整体的毒性，导致生长减慢、呕吐、嗜睡以及下丘脑的改变，体内色氨酸和血清素含量升高，引起妊娠母猪外周血淋巴细胞的增殖反应和程序性细胞死亡。
[0004]丙酮酸脱氢酶E1β亚基(pyruvate dehydrogenase E1 subunitbeta，PDHB)也被命名为PHE1B，存在于线粒体中，是丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDH)的组成酶之一，负责催化氧化脱羧反应的第一个反应，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供PDHB基因在抗镰刀菌酸中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术研究发现敲除PDHB基因，可以提高细胞对镰刀菌酸的耐受性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供敲除或抑制PDHB基因表达的试剂在制备提高生物体对镰刀菌酸的耐受性的产品中的应用。
[0008]进一步地，所述试剂包括PDHB基因敲除载体。
[0009]进一步地，所述PDHB基因敲除载体的构建方法包括：对目的基因PDHB设计sgRNA，所述sgRNA退火形成dsDNA，之后连接到线性化CRISPR/Cas9基因编辑载体上，即得所述PDHB基因敲除载体。
[0010]进一步地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示。
[0011]进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为PX459载体上。
[0012]进一步地，所述退火的反应体系为：100μM反向Oligo DNA 1μL，100μM正向Oligo DNA 1μL，10
×
T4连接缓冲液1μL，H2O 6.5μL，10U/μL T4 PNK 0.5μL。
[0013]进一步地，所述退火的反应程序为：37℃30min；95℃5min；5℃/min梯度降至25℃。
[0014]本专利技术提还供一种抗镰刀菌酸的产品，包括敲除或抑制PDHB基因表达的试剂。
[0015]进一步地，所述产品包括药物、添加剂或脱毒剂。
[0016]本专利技术还提供一种提高生物体对镰刀菌酸耐受性的方法，其特征在于，包括敲除或抑制PDHB基因表达的步骤。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018]本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，建立目的基因敲除的IPEC
‑
J2细胞系。对目的基因PDHB设计sgRNA，以质粒pSpCas9(BB)
‑
2A
‑
Puro(pX459)为载体，将退火后的sgRNA连接到线性化pX459载体上，得到敲除载体。以瞬时转染的方式将构建完成的载体送至IPEC
‑
J2细胞中，经嘌呤霉素压力筛选得到PDHB基因缺失的IPEC
‑
J2单克隆细胞系。研究发现敲除PDHB基因后细胞系与对照组相比，在50和25μg/mL镰刀菌酸浓度的条件细胞活力分别极显著提高26.06％(**P<0.01)和31.63％(***P<0.001)，对镰刀菌酸具有明显的耐受性。本专利技术为预防镰刀菌酸造成的不良反应提供一个潜在的解决途径，并为镰刀菌酸对猪生产业的危害防控提供理论依据。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为pSpCas9
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2A
‑
Puro(PX459)V2.0载体图谱；
[0021]图2为PX459(PDHB
‑
sgRNA)质粒测序图谱图；
[0022]图3为PDHB野生型IPEC
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J2细胞系CRISPR靶位点测序峰图，框线部分表示sgRNA靶点；
[0023]图4为PDHB突变型IPEC
‑
J2细胞系CRISPR靶位点测序峰图，框线部分表示sgRNA靶点；
[0024]图5为IPEC
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J2细胞PDHB野生型与突变型单克隆细胞系sgRNA靶位点区域比对图及突变情况；
[0025]图6为不同浓度FA对IPEC
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J2细胞PDHB野生型和突变型细胞活力影响(9d)。
具体实施方式
[0026]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0027]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0028]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规
技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0029]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除或抑制PDHB基因表达的试剂在制备提高生物体对镰刀菌酸的耐受性的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括PDHB基因敲除载体。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PDHB基因敲除载体的构建方法包括：对目的基因PDHB设计sgRNA，所述sgRNA退火形成dsDNA，之后连接到线性化CRISPR/Cas9基因编辑载体上，即得所述PDHB基因敲除载体。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.4
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5所示。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为PX459载体上。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚春鹏，施炜涛，张长远，张晓爱，郭金菊，钟玉娟，杜虎，薛舒丹，徐颖超，金庆敏，
申请(专利权)人：广东省农业科学院设施农业研究所，
类型：发明
国别省市：