一种双向导碱基基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及一种双向导碱基基因编辑系统及其应用。所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件；所述向导元件包括gRNA1载体和gRNA2载体；所述gRNA1载体含有至少一个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列和/或PBS序列，所述gRNA2载体含有至少一个靶向靶标位点但不产生切割的gRNA序列和PBS序列，同一个靶标位点的gRNA序列和PBS序列位于不同gRNA载体上。无论是针对FANCF基因还是RNF基因，本发明专利技术的CRISPR/DPE系统、CRISPR/DDPE系统明显提高了靶标位点的编辑效率，说明CRISPR/DPE系统具有广泛适用性。说明CRISPR/DPE系统具有广泛适用性。说明CRISPR/DPE系统具有广泛适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种双向导碱基基因编辑系统及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，尤其是涉及一种CRISPR/DPE系统、CRISPR/DDPE系统及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9技术是近年来发展迅速、备受青睐的一项基因编辑技术，该技术因其简单方便和效率高的特性而被广泛应用于许多领域。最新的CRISPR/PE系统，是在传统CRISPR/Cas9系统的基础上改造而来，在一定程度上减少了脱靶风险，具有更高的精准度和灵活性，可以实现4种单碱基的自由转换、多碱基的精准插入与删除。CRISPR/PE系统与CRISPR/Cas9系统的不同点在于科研人员对sgRNA进行了改造，其在sgRNA的3
’
末端增加了一段RNA序列，形成pegRNA；与普通的sgRNA不同，这种pegRNA不但具有引物结合位点(PBS区域)，能够结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带逆转录的模板(RT区域)，其上携带有目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑或者修复。同时将Cas9酶的变体(H840A突变型，只切断含PAM的靶点DNA链)与逆转录酶融合，形成融合蛋白复合体。Cas9
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逆转录酶融合蛋白会在pegRNA的引导下，精准地切开一条DNA链，然后根据逆转录模板，合成含有正确序列的DNA，细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组，从而达到突变或者修复的效果，如图1所示。
[0003]不过目前的CRISPR/PE系统存在效率低下的问题，已有多种改进方法提高效率，比如在pegRNA的3
’
端加上一小段环状结果减缓降解速度，或者改造pegRNA的PBS序列和RT序列的长短，皆能在一定程度上提高系统的编辑效率。不过这些方法都没有考虑pegRNA载体上的反向互补序列(PBS区域和gRNA site区域)存在一定的自连概率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种CRISPR/DPE系统、CRISPR/DDPE系统及其应用，将靶标位点的PBS序列和gRNA序列分别置于两条不同的gRNA载体上，避免pegRNA载体上的反向互补序列自连，从而提高编辑效率。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]本专利技术提供了一种双向导碱基基因编辑系统，所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件；
[0007]所述向导元件包括gRNA1载体和gRNA2载体；所述gRNA1载体含有至少一个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列和/或PBS序列，所述gRNA2载体含有至少一个靶向靶标位点但不产生切割的gRNA序列和PBS序列，同一个靶标位点的gRNA序列和PBS序列位于不同gRNA载体上。
[0008]与传统的CRISPR/PE系统相比，在已测试的基因位点，本专利技术将靶向靶位点的PBS序列和gRNA序列分别置于两条不同的gRNA载体上，避免pegRNA载体上的反向互补序列自连，进而更好地提高系统的编辑效率。
[0009]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，所述gRNA1载体含有单个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列，gRNA2载体含有单个靶向靶标位点且不产生切割的gRNA序列和同一个靶标位点的PBS序列。
[0010]经过专利技术人创造性劳动，最终获得本专利技术的双向导碱基基因编辑系统，当含有单个靶标位点时，将单个靶标位点的PBS区域设计在gRNA2载体上，gRNA site区域设计在gRNA1载体上，其中gRNA1载体只带有单个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列(20bp)，而gRNA2载体则包括了含有单个靶向靶标位点区域但不产生切割的gRNA序列(14
‑
16bp)和含有单个靶标位点的PBS序列(13
‑
21bp)，获得的双向导碱基基因编辑系统命名为CRISPR/DPE系统，当靶标位点的PBS序列和gRNA序列分别置于两条不同的gRNA载体上，避免pegRNA载体上的反向互补序列自连，进而更好地提高系统的编辑效率。
[0011]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，所述gRNA1载体含有靶向靶标位点1且产生切割的gRNA序列和含有靶标位点2的PBS序列，所述gRNA2载体含有靶向靶标位点2的gRNA序列和含有靶标位点1的PBS序列；靶标位点1和靶标位点2为不同靶标位点。
[0012]同时，本专利技术还设计了双靶标位点的双向导碱基基因编辑系统，其中gRNA1载体带有靶向靶标位点1且产生切割的gRNA序列(20bp)和靶标位点2的PBS序列(13
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21bp)，而gRNA2载体包括了含有靶向靶标位点2的gRNA序列(20bp)和含有靶标位点1的PBS序列(13
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21bp)，获得的双向导碱基基因编辑系统命名为CRISPR/DDPE系统；同一个靶位点的PBS序列和gRNA序列分别置于两条不同的gRNA载体上，避免pegRNA载体上的反向互补序列自连，进提高了双向导碱基基因编辑系统的编辑效率。
[0013]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，所述基因包括FANCF基因或RNF基因。
[0014]本专利技术依据Cas9的PAM区原则在人类基因组上寻找可用的sgRNA位点，并设计相应的RT和PBS序列，以提高双向导碱基基因编辑系统的编辑效率。
[0015]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，当基因为FANCF基因、只含有单个靶标位点时，所述gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示；所述PBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示；所述FANCF基因还包括RT序列，所述RT序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6
‑
7所示。
[0016]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，当基因为FANCF基因、含有双靶标位点时，所述gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:8
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9所示；所述PBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:10
‑
11所示；所述FANCF基因还包括RT序列，所述RT序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:12
‑
13所示。
[0017]作为本专利技术所述双向导碱基基因编辑系统的优选实施方式，当基因为RNF基因、只含有单个靶标位点时，所述gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14
‑
15所示，所述PBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；当基因为RNF基因、含有双靶标位点时，所述gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14
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15所示，所述PBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:16
‑
17所示；所述RNF基因还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双向导碱基基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件；所述向导元件包括gRNA1载体和gRNA2载体；所述gRNA1载体含有至少一个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列和/或PBS序列，所述gRNA2载体含有至少一个靶向靶标位点但不产生切割的gRNA序列和PBS序列，同一个靶标位点的gRNA序列和PBS序列位于不同gRNA载体上。2.如权利要求1所述的双向导碱基基因编辑系统，其特征在于，所述gRNA1载体含有单个靶向靶标位点且产生切割的gRNA序列，gRNA2载体含有单个靶向靶标位点且不产生切割的gRNA序列和同一个靶标位点的PBS序列。3.如权利要求1所述的双向导碱基基因编辑系统，其特征在于，所述gRNA1载体含有靶向靶标位点1且产生切割的gRNA序列和含有靶标位点2的PBS序列，所述gRNA2载体含有靶向靶标位点2的gRNA序列和含有靶标位点1的PBS序列。4.如权利要求1所述的双向导碱基基因编辑系统，其特征在于，所述基因包括FANCF基因或RNF基因。5.如权利要求4所述的双向导碱基基因编辑系统，其特征在于，当基因为FANCF基因、只含有单个靶标位点时，所述gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示；所述PBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4
‑
5所示；所述FANCF基因还包括RT序列，所述RT序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6
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7所示。6.如权利要求4所述的双向导碱基基因编辑系...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹庆剑，郑雨龄，周小青，唐成程，陈敏，金银戈，陈涛，郑伟，李万胜，资崯，徐巨才，陈静，郭素琴，赖良学，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：