一种提高细胞瞬时转染蛋白表达的方法技术

本发明专利技术提供了一种293F细胞瞬时转染蛋白表达的方法，方法包括以下步骤：(1)细胞复苏与传代；(2)转染293F细胞。本发明专利技术解决了当前重组蛋白在293F细胞中瞬时表达水平低，导致生产成本高的技术问题，实现了提高重组蛋白在293F细胞瞬时表达水平，降低了生产成本的的技术效果。果。

【技术实现步骤摘要】
一种提高细胞瞬时转染蛋白表达的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白表达
，具体而言，涉及一种293F细胞瞬时表达目标蛋白的方法及其应用。

技术介绍

[0002]哺乳动物细胞瞬时转染能在短期内快速表达高活性蛋白而被广泛应用。瞬时转染是指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内，该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂，外源基因会逐渐丢失。质粒在细胞内能够存在3
‑
4天，此时间内，质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到极为少量的蛋白。这一整个快速转染得到蛋白的过程就称为瞬时转染表达。
[0003]哺乳动物细胞自身具有蛋白折叠和翻译后修饰的功能，获得的蛋白更具有天然活性。哺乳动物细胞生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染的特点是短期快速表达，满足蛋白的小量制备，但是存在表达水平低，成本高的瓶颈。
[0004]293F细胞是从HEK293细胞中分离出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞，悬浮培养后瞬时转染293F细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外蛋白的便捷方式。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于：克服现有技术中的不足，提供一种提高细胞瞬时转染蛋白表达的方法，此方法工艺可提高哺乳动物细胞瞬时转染蛋白表达水平，降低生产成本。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种提高细胞瞬时转染蛋白表达的方法，包括以下两大步骤：
[0008]一、细胞复苏与传代
[0009]1)提前将水浴锅打开37℃；培养基提前在37℃预热1h；
[0010]2)从液氮罐中取出冻存的293F细胞
[0011]3)把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其快速融化(约1min)，融化后从水浴锅中取出。
[0012]4)用75％乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内，用枪轻轻吸出复苏的细胞全部转移到含10mL培养基的15mL离心管中，离心5min，转速800rmp。
[0013]5)取出离心后的细胞，将上清全部去除，取少许新鲜培养基重悬细胞，将重悬后的细胞再转移到培养瓶中，加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取0.5ml细胞计数及活力检测，使密度控制在0.5
‑
0.6
×
106cells/mL，活力>90％。
[0014]6)将复苏后细胞放置于培养箱中，110rpm，37℃，8％ CO2培养
[0015]7)细胞培养2
‑
3天，取0.5ml细胞进行计数和活力检测，细胞密度达到3.0
×
106cells/mL左右，活力>90％时需对细胞进行传代。
[0016]8)从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞
[0017]培养物稀释(留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定)
[0018]9)放入培养箱中110rpm，37℃，8％CO2，继续培养。
[0019]10)每天取细胞进行密度及活力检测，每3天细胞密度应达到3
‑5×
106cells/mL，对细胞进行传代
[0020]二、转染293F细胞
[0021]1)转染前1天将293F细胞悬浮培养至0.5L，接种密度为2.0
×
106cells/mL，置于培养箱中110rpm，37℃，8％ CO2培养
[0022]2)转染当天使细胞生长至3.0
‑
5.0
×
106cells/mL，活力98％，用培养基稀释至3.0
×
106cells/mL，多余丢弃
[0023]3)取2份预热的20mL转染缓冲液，其中一份加入质粒1000ug DNA，另一份加入3000ul转染试剂，分别混匀
[0024]4)将混匀后的转染试剂加入混匀后的质粒DNA中，吸管吹吸混匀6
‑
8次，37℃温育10min
[0025]5)将温育后的质粒DNA
‑
转染试剂复合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃，8％CO2培养
[0026]6)转染后4h，取30ml细胞分别加入不同组分不同浓度的补料试剂(添加方案见下表)，放入培养箱中110rpm，37℃，8％CO2继续培养。
[0027]7)每天取0.2ml细胞进行密度和活力检测，5天后收集样品进行纯化检测，对获得蛋白测浓度定量。
附图说明
[0028]图1为本专利技术提供的添加补料试剂后day1
‑
day5的293F细胞的密度图；
[0029]图2为本专利技术提供的添加补料试剂后day1
‑
day5的293F细胞的活力图；
[0030]图3为本专利技术提供的添加补料试剂后细胞表达量对比图；
[0031]表1
[0032]实验编号转染后添加补料试剂及浓度对照组10对照组25mM丙酸钠对照组310mM丙酸钠对照组415mM丙酸钠对照组51mM丙戊酸钠对照组62mM丙戊酸钠对照组73mM丙戊酸钠对照组80.3mM硫酸钠对照组90.6mM硫酸钠对照组101mM硫酸钠对照组110.5mM丁酸钠对照组121mM丁酸钠对照组131.5mM丁酸钠
[0033]补料试剂包括丙酸钠，丙戊酸钠，硫酸钠，丁酸钠；丙酸钠添加浓度范围为0
‑
15mM；
[0034]丙戊酸钠添加浓度范围为1
‑
3mM；硫酸钠添加浓度范围为0.3
‑
1mM；丁酸钠添加浓度范围为0.5
‑
1.5mM。
[0035]表2
[0036]实验编号转染后细胞添加补料试剂及浓度表达量(mg/L)对照组1050对照组25mM丙酸钠67对照组310mM丙酸钠43对照组415mM丙酸钠28对照组51mM丙戊酸钠154对照组62mM丙戊酸钠136对照组73mM丙戊酸钠78对照组80.3mM硫酸钠53对照组90.6mM硫酸钠55对照组101mM硫酸钠48对照组110.5mM丁酸钠75对照组121mM丁酸钠103对照组131.5mM丁酸钠63
[0037]根据图1、图2、图3这3个图结果得知，在转染293F细胞后4h添加补料试剂硫酸钠对蛋白表达量提升没有作用，而丙酸钠，丙戊酸钠，丁酸钠都有增强蛋白表达的效果，其中丙戊酸钠和丁酸钠对蛋白表达量提升效果更明显；从实验结果显示添加不同浓度对蛋白表达量影响也不相同，其中添加1mM丙戊酸钠和1mM丁酸钠的蛋白表达量最高，是对照组的2
‑
3倍。
具体实施方式
[0038]以下实施例用于说明本专利技术，但是不用来限制本专利技术的范围。若未明确指明，实施例中的所用的技术手段为为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市面在售商品。
[0039]以下所述内容，技术手段均在上文中有所表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种293F细胞瞬时表达目标蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞复苏和传代培养；(2)待转染质粒，转染试剂准备；(3)瞬时转染293F细胞；(4)转染后细胞培养，并添加补料试剂和补料培养基，获得蛋白瞬时表达细胞上清和蛋白检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(2)包括：转染质粒提取，及质粒浓度和纯度检测；转染试剂配制。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(3)包括：转染细胞密度和活力检测，转染试剂
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质粒DNA复合物制备，将复合物添加至待转染细胞中。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴瞻，宋丹，高歌，
申请(专利权)人：南京欧凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：