一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。该报告质粒包括功能目的片段，功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶，功能目的片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用流感病毒感染诱导荧光成像与生物成像的报告质粒作为检测病毒复制的分子模型，可快速检测病毒复制。同时，该报告质粒还可用抗流感病毒药物筛选与流感疫苗中和抗体的中和滴度的评价。另外，该报告质粒的启动子为CMV，可克服种属差异性，可在广泛宿主体内表达。可在广泛宿主体内表达。可在广泛宿主体内表达。

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。

技术介绍

[0002]eGFP，即增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein)，GFP，即绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)。eGFP是GFP突变系，应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(64位苯丙一亮)，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。
[0003]Gluc：是Gaussia萤光素酶，为萤光素酶的一种。
[0004]pcDNA3.1
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puro(+)是由目前最常用的哺乳动物表达载体之一的PCDNA3.1(+)改造过来，载体使用CMV强启动子调控外源基因的表达。载体拷贝数很高，表达量也很高。无荧光标记，无tag标签。Amp+原核筛选抗性，puro+真核筛选抗性，可以利用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。
[0005]目前常规检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，包括功能目的片段，所述功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因的片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶。2.根据权利要求1所述一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，所述报告基因为eGFP或Gluc，其侧翼序列为A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5
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NCR与3
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NCR基因片段，其两端的外侧为具有剪切功能的锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz以及相应的限制性内切酶的酶切位点Nhe I和Not I序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。4.一种如权利要求1
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3任一项所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的构建方法，其特征在于，将所述功能目的片段用限制性内切酶从模板上切下，连接到pcDNA3.1
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puro载体质粒上，由此构成流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，即pcDNA3.1
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puro
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eGFP/pcDNA3.1
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puro
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Gluc。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计含有A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的两端NCR、带有自剪切功能的核酶及中间开放阅读边框为eGFP或Gluc的功能目的片段，并加入酶切位点Nhe I和Not I；以pEGFP
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N1或pTK
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Gluc为模板，进行PCR扩增；以pEGFP
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N1为模板时，引物序列如下所示:eGFP
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F:ATAGCTAGCTGTTTCTACTCTGATGAGG；eGFP
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R:ATAGCGGCCGCTGGC；以pTK
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Gluc为模板时，引物序列如下所示:Gluc
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F:ATAGCTAGCCTGATGAGGCCGAAAGGCC；Gluc
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R:ATAGCGGCCGCTGGCTCTCCCTTAGCCATCC；(2)胶回收纯化PCR产物；(3)将胶回收纯化的PCR产物及pcDNA3.1
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puro载体质粒分别用限制性内切酶Nhe I和Not I
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HF进行双酶切，得到目的片段酶切产物和pcDNA3.1
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puro载体酶切产物；(4)将目的片段酶切产物和pcDNA3.1
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puro载体酶切产物用T4连接酶连接；(5)将连接产物加入DH5α感受态细胞中，进行转化；(6)挑取单克隆菌落摇床中震荡，扩大培养，并进行PCR鉴定，将阳性菌液进行扩大培养，进行质粒抽提并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应体系如下：模板pEGFP
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N1或pTK
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Gluc1μL，eGFP
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F或Gluc
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F引物2μL，eGFP
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R或Gluc
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R引物2μL，PCR Mix 25μL，加入无菌去离子水至50μL；PCR反应条件如下：95℃预变性1min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；降温至12℃结束反应；步骤(1)和步骤(2)之间，还包括以下步骤：取50μL PCR扩增产物，加10μL上样缓冲液，混匀后点样于1.5％的琼...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜涛，户义，李靖，杨文广，冯烨，张森，陈月红，康晓平，李裕昌，李威，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：