一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法；其特征在于：包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液；其中，所述DNA结合液由20％PEG

【技术实现步骤摘要】
一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法。

技术介绍

[0002]质粒(Plasmid)广泛存在于生物界，是常见于原核细菌和真菌细胞中能独立于寄主染色体自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1～300kb。将一个外源目的基因导入细胞，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具被称为载体(vector)。基因工程上所用述的载体特指一类能独立于细胞核DNA而自我复制的核酸分子，通过限制性核酸内切酶和核酸连接酶将目的基因剪辑至具有完整表达元件的启动子后，能够在宿主细胞中将目的基因进行转录和翻译。通过电转、PEI、磷酸钙等方法将载体转入真核细胞，与转入细菌表达系统相比，真核表达系统所表达出的蛋白更接近蛋白天然的空间结构。
[0003]在产品研发阶段，纳克级质粒即可满足研发需求，虽然质粒的需求量低，但是如果不能保证质粒的纯度，仍会给研发造成较大的困扰。而对于抗体等生物大分子的大量生产，则需要mg至g级的无内毒素质粒。现有无内毒素或低内毒素质粒提取试剂盒或是使用成本较高，或是内毒素仍不能满足真核表达系统转染需求。真核表达系统所需要的质粒除纯度外，对质粒的超螺旋比例也有较高的要求，一般大于90％的超螺旋比例才会有较好的转染结果，而超螺旋比例较低则会导致转染效率低下。
[0004]综上所述，需要开发一种低毒、简便、廉价的适用于真核表达系统的细菌质粒DNA提取方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是：提供一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法，用于克服上述技术问题中的至少一种。
[0006]为实现上述目的，本专利技术中采用的技术方案如下：
[0007]一种低内毒素质粒提取试剂盒，包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液。
[0008]进一步的，所述DNA结合液由20％PEG6000、2.5M NaCl、1％MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。
[0009]进一步的，所述洗涤液A由MOPS、RNase A溶解于PBS中形成。
[0010]进一步的，所述裂解液由NaOH、SDS十二烷基硫酸钠溶解于水中制得；
[0011]所述中和沉淀液的配制方法为：1L中和沉淀液中，乙酸钾300.0g，冰乙酸250.0g其余为水；
[0012]所述孵育液的配制方法为：1L孵育液中，包括10g Triton X
‑
114，10.0gMOPS，
43.83g NaCl，150.0g异丙醇，其余为水。
[0013]进一步的，所述洗杂液的配制方法为：20mg多粘菌素B(PMXB)、1.0gPEG6000，7.30g NaCl，1g MOPS，使用超纯水定容至100mL；
[0014]所述洗涤液B的的配制方法为：取800mL无水乙醇，使用二次去离子水定容至1L；
[0015]所述质粒溶解液的配制方法为：吸取1M Tris
‑
HCl(pH 7.4)1mL和0.5mM EDTA(pH 7.4)0.2mL至100mL容量瓶中，使用无菌水定容至100mL。
[0016]本专利技术的目的是：提供一种低内毒素质粒的提取方法，用于克服上述技术问题中的至少一种。
[0017]一种质粒提取试剂盒提取质粒的方法，包括以下步骤：
[0018](1)菌体培养及收集：收集处于对数生长中后期，活细胞较多的菌体沉淀；
[0019](2)质粒粗品制备：收集的菌体沉淀经重悬，裂解，沉淀杂质后过滤得到含有质粒的上清；
[0020](3)质粒DNA纯化：使用含有硅醇基的硅胶或羧基硅胶磁珠吸附质粒，通过微孔筛网过滤的方法去除内毒素、盐离子和其他杂质，最终使质粒溶于无内毒素的质粒溶解液中。
[0021]当使用含有硅醇基的硅胶作为纯化介质时，使用的过滤材料为10μm无菌筛网，该筛网有两种规格，即可以搭配15mL离心管和50mL离心管使用。
[0022]当使用磁珠硅胶作为纯化介质时，搭配磁铁或电磁铁使用，条件允许则使用商品化核酸提取仪使用。
[0023]有益效果
[0024]本专利技术中平均0.5g菌体可以提出1.2mg合格质粒，与现有方法相比，本专利技术中所使用的的试剂、耗材和设备均为国产，且试剂为分析纯，价格低廉，经成本测算，每1mg质粒的提取可以将成本控制在40～50元，且内毒素低于1EU/mL，低于业内要求的无内毒素标准(＜0.01EU/uL)，实验过程中使用的耗材(如离心管和硅胶)可经碱法回收，实际上可将成本进一步降低，符合我国节能减排的环保要求。使用本方法可以在1h内获得mg级无内毒素适用于转染的质粒，且适用于单人操作，过程中并未使用耗时费力的离心步骤，节省了大量生产时间，提高了质粒生产效率。使用单分散球形羧基磁珠替代硅胶搭配核酸提取仪则可以进一步解放实验人员。
附图说明
[0025]图1：提取质粒凝胶电泳检测。
[0026]其中M为1kB DNA ladder；1～8分别为24孔板E中A1、C1、B2、D2、A4、D4、A6和C6孔中质粒样本。
具体实施方式
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。如没有特别强调温度，通常指在室温下进行反应，本专利技术中的室温是指10～30℃。
[0028]本专利技术的技术方案：
[0029]根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。本专利技术所使用的试剂耗材均为国产，如无特殊说明，均为市售商品。
[0030]实施例1：利用硅醇基的硅胶纯化质粒
[0031]收集处于对数生长中后期，活细胞较多的菌体沉淀0.4g于50mL离心管中，加入40mL洗涤液A，涡旋震荡2min，6000rpm离心5min，弃去上清。向沉淀中加入10mL 1
×
PBS，涡旋震荡2min，加入10mL裂解液，旋紧瓶盖，上下颠倒5
‑
6次，静置观察管内变澄清后缓慢加入中和沉淀液10mL，上下颠倒5
‑
6次，使用10μm无菌筛网过滤至新的50mL离心管中，即可获得质粒粗品。
[0032]硅胶工作液配制：称取1g硅胶，加入10mL DNA结合液，涡旋后自然沉降，弃上清至固液比为1:1备用。
[0033]取20mL质粒粗品，加入2mL孵育液，涡旋震荡1min，4℃静置10min后加入预冷的DNA结合液10mL，涡旋震荡1min，加入预处理的硅胶工作液1mL，将试管放置在4℃摇床中160rpm结合15
‑
20min。
[0034]在超净工作台中，取新的10μm无菌筛网于50mL离心管上，将结合后的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液。2.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述DNA结合液由20％PEG6000、2.5MNaCl、1％MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。3.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述洗涤液A由1％MOPS、1％RNaseA溶解于1
×
PBS中形成。4.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液由1％SDS十二烷基硫酸钠溶解于水中并使用6MNaOH调pH≥14制得。5.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：中和沉淀液由30％乙酸钾300.0g，25％冰乙酸并用纯水定容。6.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：孵育液由1％TritonX
‑
114，1％MOPS，2.5MNaCl，15％异丙醇组成，并用纯水定容。7.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔慧琳，万涛，程娓，高歌，
申请(专利权)人：南京欧凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：