一种利用转座酶进行链特异性建库的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用转座酶进行链特异性建库的方法，该方法包括：制备带有dU序列接头的Tn5转座酶；提取总RNA，纯化得到mRNA；逆转录形成cDNA双链产物；先切割cDNA双链产物，然后回收纯化，再补平末端；最后降解双链DNA产物中的含U模板，进行PCR扩增建库。本发明专利技术根据转座酶能够切割DNA的特征，利用高保真酶3

【技术实现步骤摘要】
一种利用转座酶进行链特异性建库的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用转座酶进行链特异性建库的方法。

技术介绍

[0002]普通的转录组测序文库是无法保留转录本的方向信息的，而很多基因区域都存在着正反义链的转录本，尤其是大多数非编码RNA都来自反义链。链特异性转录组测序是指在文库构建过程中将RNA链的方向信息保存到测序文库中，测序后的数据分析可以确定转录本是来自正义链还是反义链。链特异性测序在研究基因新的转录本，发现非编码RNA，研究可变剪切，基因组注释，基因表达特征等研究中都发挥着重要的功能。链特异性建库能够获得更准确的基因表达定量，提高发掘circRNA的准确率，识别非编码反义转录本，更好地预测新转录本，进行原核生物操纵子分析等多种应用场景。人们将已经发表的链特异性测序的方法从链特异性占比，文库复杂度，覆盖的均匀性和连续性，与已知注释的一致性以及表达分析的准确性等方面进行比较分析，结果表明，dUTP二链法和Illumina RNA连接法可以作为主流方法，用于链特异性建库。
[0003]目前，分子试剂市场上链特异性测序的试剂盒，主要采用了dUTP二链法进行链特异性建库。其原理是：通过Poly A捕获或去除了rRNA之后的RNA，片段化后用随机引物逆转录合成cDNA第一链，在合成第二链时用dUTP替代dTTP，接头连接后用UDG酶将合成的第二链降解，只留下两端带有不同序列接头的cDNA第一链进入后续的PCR扩增环节，扩增出来的文库就保留了RNA的方向性。链特异性文库除了在二链合成时与普通转录组文库有所不同之外，在一链合成时也会多加入一个试剂——放线菌素D(Actinomycin D)，它能抑制聚合酶在合成cDNA一链的过程中同时合成cDNA二链。
[0004]然而，采用常见的dUTP二链法进行链特异性建库试剂盒进行建库，经过mRNA富集(mRNA capture)，mRNA片段化(mRNAfragmentation)，一链合成(First strand cDNAsynthesis)，二链合成(Second strand cDNA synthesis)，末端修复(End repair)，末端加dA(dA
‑
Tailing)，接头连接(Adapter ligation)，去除含U链(Second strand cDNA digestion)，PCR富集(PCR enrichment)，文库片段分选等步骤。该方法步骤较多，耗时较长，完成8个文库构建耗时约5
‑
6小时，且成本也较高。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种利用转座酶进行链特异性建库的方法，该方法利用转座酶进行链特异性建库不仅不需要mRNA片段化(mRNA fragmentation)，而且在二链合成之后也不需要末端修复(End repair)，末端加dA(dA
‑
Tailing)和接头连接(Adapter ligation)；在建库未完成后也不需要片段分选操作；操作相对简洁，并产生了高质量的链特异性文库；为链特异性建库方法提供了一种新的选择。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种利用转座酶进行链特异性建库的方法，包括以下步骤：
[0008](1)合成带有dU序列的转座酶接头引物，制备用于链特异性建库的带有dU序列接头的Tn5转座酶；
[0009](2)提取植物组织的总RNA，从总RNA中纯化得到mRNA；
[0010](3)以步骤(2)的mRNA为模板，利用反转录酶逆转录生成cDNA的第一链，形成mRNA/cDNA杂交链；
[0011](4)采用置换合成法，利用RNA酶H消化步骤(3)的mRNA/cDNA杂交链，在mRNA链上造成切口和缺口，从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物；并在DNA聚合酶I的作用下合成第二链，形成cDNA双链产物；
[0012](5)利用步骤(1)的Tn5转座酶对步骤(4)的cDNA双链产物进行切割，得到cDNA双链片段；
[0013](6)利用DNA纯化磁珠对步骤(5)切割后的cDNA双链片段进行回收纯化，得到切割后的双链DNA片段；
[0014](7)利用DNA聚合酶对步骤(6)切割后的双链DNA片段的末端进行补平，得到补平后的双链DNA产物；
[0015](8)利用尿嘧啶DNA糖基化酶降解步骤(7)双链DNA产物中的含U模板，得到降解后的产物；
[0016](9)以步骤(8)降解后的产物为模版，利用高保真酶进行PCR扩增建库。
[0017]本专利技术根据转座酶能够切割DNA的特征，利用高保真酶3
’‑5’
外切酶活性(也称校对活性)和尿嘧啶停滞(Uracil Stalling)特性，精心设计了带有dU序列的转座酶接头引物，从而在转座酶切割粘贴接头序列后，只有特定方向插入的DNA能被扩增建库，从而达到链特异性建库的目的。
[0018]进一步地，步骤(1)中，所述链特异性建库的带有dU序列接头的Tn5转座酶由Tn5转座酶、常规双链接头I、带有dU序列的双链接头II按照1:0.5:0.5的摩尔比例孵育生成。
[0019]进一步地，所述常规双链接头I由引物A与引物B退火形成；所述带dU序列的双链接头II由引物A与带dU序列的引物C退火形成；
[0020]所述引物A包含转座酶识别的mosaic end序列片段，5
’
端磷酸化，3'端氨基AminolinkerC7修饰；引物B的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为测序接头序列；带dU序列的引物C的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为dT被dU代替的测序接头序列。
[0021]步骤(1)中所述的带有dU序列的转座酶接头引物即是带dU序列的引物C，是指常规用于转座酶包埋的接头引物，其5
’
端14
‑
15个脱氧核糖核苷酸序列中，dT被dU替换的序列。
[0022]作为优选，所述引物A如SEQ ID NO.1所示，具体为：5'
‑
phos
‑
CTGTCTCTTATACACATCT
‑
NH2‑
3'(5'
‑
Phosphate,3'
‑
AminolinkerC7)；引物B如SEQ ID NO.2所示，具体为：5
′‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
‑3′
；带dU的引物C如SEQ ID NO.3所示，具体为：5
′‑
G/ideoxyU/C/ideoxyU/CG/ideoxyU/GGGC/ideoxyU/CGGAGATGTGTATAAGAGACAG
‑3′
。其中，常规双链接头I由SEQ ID NO.1和S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用转座酶进行链特异性建库的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成带有dU序列的转座酶接头引物，制备用于链特异性建库的带有dU序列接头的Tn5转座酶；(2)提取植物组织的总RNA，从总RNA中纯化得到mRNA；(3)以步骤(2)的mRNA为模板，利用反转录酶逆转录生成cDNA的第一链，形成mRNA/cDNA杂交链；(4)采用置换合成法，利用RNA酶H消化步骤(3)的mRNA/cDNA杂交链，在mRNA链上造成切口和缺口，从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物；并在DNA聚合酶I的作用下合成第二链，形成cDNA双链产物；(5)利用步骤(1)的Tn5转座酶对步骤(4)的cDNA双链产物进行切割，得到cDNA双链片段；(6)利用DNA纯化磁珠对步骤(5)切割后的cDNA双链片段进行回收纯化，得到切割后的双链DNA片段；(7)利用DNA聚合酶对步骤(6)切割后的双链DNA片段的末端进行补平，得到补平后的双链DNA产物；(8)利用尿嘧啶DNA糖基化酶降解步骤(7)双链DNA产物中的含U模板，得到降解后的产物；(9)以步骤(8)降解后的产物为模版，利用高保真酶进行PCR扩增建库。2.如权利要求1所述的利用转座酶进行链特异性建库的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述链特异性建库的带有dU序列接头的Tn5转座酶由Tn5转座酶、常规双链接头I、带有dU序列的双链接头II按照1:0.5:0.5的摩尔比例孵育生成。3.如权利要求2所述的利用转座酶进行链特异性建库的方法，其特征在于，所述常规双链接头I由引物A与引物B退火形成；所述带dU序列的双链接头II由引物A与带dU序列的引物C退火形成；所述引物A包含转座酶识别的mosaic end序列片段，5
’
端磷酸化，3'端氨基AminolinkerC7修饰；引物B的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为测序接头序列；带dU序列的引物C的3
’
端为与引物A反向互补的序列，5
’
端为dT被dU代替的测序接头序列。4.如权利要求3所述的利用转座酶进行链特异性建库的方法，其特征在于，所述引物A如SEQ ID NO.1所示，具体为：5'
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phos
‑
CTGTCTCTTATACACATCT
‑
NH2‑
3'(5'
‑
Phosphate,3'
‑
AminolinkerC7)；引物B如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，具体为：5
′‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐盛春，陶晓园，李素娟，陈光，王剑，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：