一种支气管扩张猪模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种支气管扩张猪模型的构建方法及其应用。本发明专利技术利用基因编辑技术在猪PKD1基因4号外显子处引入插入突变，敲除猪PKD1基因，构建了一种肺支气管扩张病基因突变猪模型，本发明专利技术建立的支气管扩张模型猪存在支气管扩张的典型特征，为目前的支气管扩张相关研究提供了新型的、更接近于人类的疾病模型，为相关疾病的临床药物筛选和有效诊疗方案的研发提供有利工具。研发提供有利工具。研发提供有利工具。

【技术实现步骤摘要】
一种支气管扩张猪模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体说是一种支气管扩张猪模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]支气管扩张是一种常见的呼吸系统疾病，表现为肺中部分支气管和细支气管永久性扩张，通常伴有支气管壁的损坏，因而是一种结构性疾病。支气管扩张有不同形态，如柱状、囊状和曲张状，症状主要包括慢性咳嗽、咳脓痰和反复咯血等。支气管扩张的发病原因和病理机制十分复杂，人们对其了解甚少，并且其病理机制可能随着发病原因的变化而有所不同，但目前并没有很好的实验动物模型用以研究支气管扩张的发病机制。因此，本专利技术希望通过构建支气管扩张动物疾病模型，给支气管扩张病的治疗带来一些新的理论和方法。
[0003]多囊肾病
‑
1(Polycystic kidney disease
‑
1，PKD1)基因编码多囊蛋白
‑
1(Polycystin
‑
1，PC1)，表达于全身各个组织器官，且在生长发育过程中受到严格调控。PKD1突变能够导致常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。而支气管扩张是ADPKD诸多重要的肾外症状之一，目前已有研究报道，ADPKD患者支气管扩张的发病率为37％，而非ADPKD的慢性肾病患者患有支气管扩张的概率只有13％。可见，PKD1基因的突变使得病人患有支气管扩张的概率升高。
[0004]使用正确的动物模型有助于人们了解疾病进展，探索、发现可以治疗的药物并进行验证，同时可以对药效学及其毒性、副作用进行评估。因此，动物模型需要能准确地模拟预期的功能或疾病，有足够的后代，并能存活足够长的时间来验证预期效果和进行药物安全性评定。现有技术壁垒在于目前支气管扩张模型都是啮齿类模型，而这些啮齿类模型并没有表现出和人类支气管扩张症状一致的表型。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种支气管扩张猪模型的构建方法。本专利技术选择在各种生理功能上与人更为接近的小型猪作为动物模型，构建支气管扩张疾病模型，为研究疾病分子机理及为治疗药物筛选提供了合适的动物模型。
[0006]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]一种支气管扩张猪模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]步骤1、利用基因编辑技术在猪PKD1基因4号外显子第356
‑
357位点处引入插入突变；
[0009]步骤2、采用PCR和测序鉴定方法筛选猪PKD1基因插入突变的猪细胞克隆点；
[0010]步骤3、将筛选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞中，在体外培养成重构胚，使用非手术法将其移入代孕母猪子宫中，妊娠生产出克隆猪；
[0011]步骤4、采用PCR和测序方法鉴定出PKD1基因突变的克隆猪。
[0012]2.如权利要求1所述的一种支气管扩张猪模型的构建方法，其特征在于：
[0013]步骤1中所述引入插入突变为：在猪PKD1基因14号外显子第356
‑
357位点处引入“A”的插入突变，上述猪PKD1基因突变序列如SEQ ID No.1所示。
[0014]3.如权利要求1所述的一种支气管扩张猪模型的构建方法，其特征在于：
[0015]步骤2中所述PCR鉴定方法使用的鉴定引物为：
[0016]引物F：5
’‑
CCCGTGCCCTGAAGGCCTGG
‑3’
；
[0017]引物R：5
’‑
GAAGTTCCCAGGCTAGGG
‑3’
。
[0018]本专利技术的另一个目的在于上述支气管猪模型的应用。
[0019]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0020]使用上述支气管扩张猪模型的构建方法构建的基因突变猪模型在针对支气管扩张病进行药物实验和临床前药物筛选中的应用。
[0021]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0022]本专利技术所述的一种支气管扩张猪模型的构建方法及其应用，其有益效果为：
[0023]本专利技术弥补了现有技术的空白，选择在各种生理功能上与人更为接近的小型猪作为动物模型，该模型能够明显反映人类支气管扩张症状的炎症过度应答和粘液过度分泌等现象。该模型可用于支气管扩张疾病分子机理，也可用于相关治疗药物的筛选。
附图说明
[0024]本专利技术有如下附图：
[0025]图1为PKD1基因编辑的靶位点。
[0026]图2为几种不同PKD1突变类型的DNA扩增片段电泳图。利用鉴定引物F/R对WT猪DNA的扩增片段大小为603bp。
[0027]图3为不同突变类型猪DNA扩增片段测序峰图。
[0028]图4为PKD1在PKD1突变猪和Control(WT)猪肺中的表达。A为猪肺PKD1表达丰度检测；B为猪肺PC1免疫荧光染色，箭头(白色)指向PC1阳性细胞，且PC1与纤毛细胞特异性标记蛋白β
‑
tubulin共染。
[0029]图5为PKD1突变猪和WT猪的MSCT显示猪肺支气管扩张检测。红色虚线框为放大部分，箭头(红色)代表“印戒征”，支气管(空心圆)直径远大于相邻血管(实心圆)直径，形状似“戒指”；箭头(黄色)代表“双轨征”，支气管没有逐渐变细。
[0030]图6为PKD1突变猪的猪肺炎症的检测。A为猪肺炎症因子基因的表达检测；B为Western blot检测猪肺组织中2年龄野生型和PKD1
+/
‑
猪肺组织TNFα和NFκB1蛋白水平及其灰度分析；C为免疫荧光染色检测2年龄野生型和PKD1
+/
‑
猪肺组织CCL2的表达。
[0031]图7为PKD1突变猪的猪肺粘液的检测。A为野生型和PKD1+/
‑
猪肺组织中含有粘液的气道数量进行统计；B为检测WT与PKD1
+/
‑
猪细支气管，虚线框代表粘液；C为猪肺组织PAS染色检测2年龄野生型和PKD1
+/
‑
猪肺气道PAS染色检测，箭头(黑色)指向PAS染色阳性的杯状细胞；D为猪肺组织MUC5AC基因表达检测。
[0032]图8为猪肺气道与相邻血管面积比检测。A为2年龄野生型和PKD1+/
‑
猪肺组织H&E染色检测气道和血管，Air代表气道(airway)，Ves代表血管(blood vessel)；B为对2年龄野生型和PKD1+/
‑
猪中气道及相邻血管的面积比进行统计。
[0033]注：以上图中的*表示＜0.05，有显著差异，**表示＜0.01，有很显著差异，***表示＜0.001，有极显著差异；NS表示无显著差异。
具体实施方式
[0034]若未特别指明，下述实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到；实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种支气管扩张猪模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、利用基因编辑技术在猪PKD1基因4号外显子第356
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357位点处引入插入突变；步骤2、采用PCR和测序鉴定方法筛选猪PKD1基因插入突变的猪细胞克隆点；步骤3、将筛选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞中，在体外培养成重构胚，使用非手术法将其移入代孕母猪子宫中，妊娠生产出克隆猪；步骤4、采用PCR和测序方法鉴定出PKD1基因突变的克隆猪。2.如权利要求1所述的一种支气管扩张猪模型的构建方法，其特征在于：步骤1中所述引入插入突变为：在猪PKD1基因14号外显子第356
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：邢怡明，王润铭，李文雅，代海婷，吴寒宇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：