一种真核细胞的电转染方法技术

本发明专利技术涉及一种真核细胞的电转染方法。该转染方法包括以下步骤：(1)采用第一缓冲液与核酸片段或含有核酸片段的质粒混合得到转染基因溶液；(2)将待转染细胞与第二缓冲液混合，静置平衡，离心取沉淀与转染基因溶液混合，静置孵育，重悬；(3)对重悬后的溶液进行100～300v，80～300μs，1～3次脉冲电击，静置孵育，第一缓冲液和第二缓冲液的pH值分别为7.2

【技术实现步骤摘要】
一种真核细胞的电转染方法


[0001]本专利技术涉及真核细胞基因导入领域，具体涉及一种真核细胞的电转染方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，是具有自我复制、多向分化潜能的成体干细胞。骨髓MSC体外分离培养容易获取，细胞免疫原性低，已成为组织工程、基因治疗和再生医学研究中理想的种子细胞。
[0003]间充质干细胞用于基因编辑、基因功能研究、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产等生物领域研究时，首先需要将外源分子如DNA，RNA等通过转染的方式导入间充质干细胞。常见的细胞转染方法主要包括：病毒感染法、脂质体转染法、电穿孔转染法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法、阳离子物质介导的转染等方法。不同的转染方法各有优缺点：
[0004]脂质体转染法：表面带正电荷的阳离子脂质体，通过静电作用，与核酸的磷酸根作用，进而将DNA分子包裹入内，形成DNA脂质体复合物，细胞膜表面带负电，能吸附脂质体复合物，再通过膜融合或胞吞作用进入细胞内。适用于悬浮或贴壁培养细胞的基因转染，操作方便，不需要专门的设备等，其转染率较高。其缺点是脂质体对细胞有一定的毒性，转染时间一般不超过60小时，对于临床应用细胞的基因导入，有潜在安全隐患。
[0005]病毒感染：可以快速、高效的实现细胞的感染，感染效率可高达100％，转染成功率高。其缺点是需要病毒包装，获取高滴度的感染病毒；病毒感染对于细胞活性有一定影响，同时病毒载体基因组可能整合入基因组能，病毒转染的方式并不能保证其安全性，无法在临床上使用，具有局限性。
[0006]电穿孔转染法：通过物理方法，改变细胞膜的通透性，通过电击，能够可逆地击穿细胞膜，形成瞬时的水通路，或使膜上小孔开放，促使DNA分子扩散进入胞内。其优势是对于临床细胞应用风险较低，无除导入片段外的外源基因导入风险，无脂质体等化合物毒性风险，能够实现较大片段基因的导入。但其缺点是高电场强度会杀死50％
‑
70％的细胞，转染效率相对较低。因此，需要专业的转染试剂保护细胞，降低细胞死亡率，同时提高转染效率。
[0007]针对真核细胞，例如人间充质干细胞的转染，最理想的方法应该是能够同时兼顾高转染效率和细胞死亡率低的方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种提高细胞转染效率，同时降低细胞死亡率的真核细胞电转染方法。
[0009]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0010]一种真核细胞的电转染方法，所述的转染方法包括以下步骤：
[0011](1)采用第一缓冲液与核酸片段或含有核酸片段的质粒混合得到转染基因溶液；
[0012](2)将待转染细胞与第二缓冲液混合，静置平衡，离心取沉淀，将所述的沉淀和所
述的转染基因溶液混合，静置孵育，重悬；
[0013](3)对所述的重悬后的溶液进行电击，电击参数为：100～300v，100～300μs，1～3次脉冲，电击后静置孵育，
[0014]其中，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液的pH值分别独立地为7.2
±
0.2，
[0015]所述的第一缓冲液的渗透压为230～280mOsmol/kg，所述的第二缓冲液的渗透压为280～320mOsmol/kg，且所述的第一缓冲液的渗透压比所述的第二缓冲液的渗透压小，
[0016]所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液分别独立地含有0.8～1.2g/L葡萄糖和0.3～0.5g/L氨基酸，且所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液中的氨基酸分别独立地为苏氨酸和/或天冬酰胺。
[0017]优选地，所述的第一缓冲液的渗透压为250～270mOsmol/kg，所述的第二缓冲液的渗透压为285～300mOsmol/kg。
[0018]优选地，所述的第一缓冲液的组分包括：2～2.5g/L氯化钾，0.05～0.1g/L磷酸二氢钾，0.1～0.15g/L磷酸氢二钾，28～32g/L肌醇，0.8～1.2g/L葡萄糖，0.3～0.4g/L苏氨酸，0.08～0.12g/L天冬酰胺，余量注射水。
[0019]优选地，所述的第二缓冲液的组分包括：2～2.5g/L氯化钾，0.05～0.1g/L磷酸二氢钾，0.1～0.15g/L磷酸氢二钾，37～40g/L肌醇，0.8～1.2g/L葡萄糖，0.3～0.4g/L苏氨酸，0.08～0.12g/L天冬酰胺，余量注射水。
[0020]优选地，所述的电击参数为：150～200v，150～250μs，1～2次脉冲。
[0021]优选地，步骤(1)中，采用所述的第一缓冲染液将核酸片段或含有核酸片段的质粒稀释至0.2～10μg/mL。
[0022]优选地，步骤(2)中，将所述的待转染细胞与所述的第二缓冲液按照1
×
10
6～5×
106个细胞/mL的浓度混合，静置平衡1～3min，800～1200r/min的转速下离心，收集沉淀并与上述转染基因溶液混合，孵育1～3min，重悬后转移至转染杯中。
[0023]优选地，在转染前，对所述的待转染细胞进行培养：转染前传代或复苏接种所述的待转染细胞至无血清培养基中，接种密度为1
×
104～5
×
104/cm2，37℃、5％CO2培养48～72h，细胞生长至70％～85％丰度，收集增殖对数期细胞进行所述的电转染。
[0024]本专利技术中，所述的核酸为DNA片段和/或RNA片段。
[0025]根据一些具体实施方式，所述的待转染细胞为人间充质干细胞。
[0026]更具体地，所述的第一缓冲液的组分包括：2.2365g/L氯化钾，0.0871g/L磷酸二氢钾，0.1361g/L磷酸氢二钾，29g/L肌醇，1g/L葡萄糖，0.35g/L苏氨酸，0.1g/L天冬酰胺，余量注射水，所述的第一缓冲液的渗透压为261mOsmol/kg。
[0027]更具体地，所述的第二缓冲液的组分包括：2.2365g/L氯化钾，0.0871g/L磷酸二氢钾，0.1361g/L磷酸氢二钾，38.2g/L肌醇，1g/L葡萄糖，0.35g/L苏氨酸，0.1g/L天冬酰胺，余量注射水，所述的第二缓冲液的渗透压约为289mOsmol/kg。
[0028]更具体地，所述的电击参数为：180v，200μs，2次脉冲。
[0029]本专利技术还提供一种真核细胞电转染试剂，所述的真核细胞电转染试剂包括上述真核细胞的电转染方法中使用的所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液。
[0030]本专利技术中，待转染细胞在第二缓冲液中平衡后再进入第一缓冲液中，细胞周围环境变化缓和，有效降低细胞死亡率，且通过优化第一缓冲液和第二缓冲液的配方，有利于在
提高转染效率的同时保护细胞适应膜渗透压的变化，降低细胞死亡率。
[0031]由于以上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真核细胞的电转染方法，其特征在于，所述的转染方法包括以下步骤：(1)采用第一缓冲液与核酸片段或含有核酸片段的质粒混合得到转染基因溶液；(2)将待转染细胞与第二缓冲液混合，静置平衡，离心取沉淀，将所述的沉淀和所述的转染基因溶液混合，静置孵育，用移液器轻柔吹打重悬细胞；(3)对所述的重悬后的溶液进行电击，电击参数为：100～300v，80～300μs，1～3次脉冲，电击后静置孵育，其中，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液的pH值分别独立地为7.2
±
0.2，所述的第一缓冲液的渗透压为230～280mOsmol/kg，所述的第二缓冲液的渗透压为280～320mOsmol/kg，且所述的第一缓冲液的渗透压比所述的第二缓冲液的渗透压小，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液分别独立地含有0.8～1.2g/L葡萄糖和0.3～0.5g/L氨基酸，且所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液中的氨基酸分别独立地为苏氨酸和/或天冬酰胺。2.根据权利要求1所述的真核细胞的电转染方法，其特征在于，所述的第一缓冲液的渗透压为250～270mOsmol/kg，所述的第二缓冲液的渗透压为285～300mOsmol/kg。3.根据权利要求1所述的真核细胞的电转染方法，其特征在于，所述的第一缓冲液的组分包括：2～2.5g/L氯化钾，0.05～0.1g/L磷酸二氢钾，0.1～0.15g/L磷酸氢二钾，28～32g/L肌醇，0.8～1.2g/L葡萄糖，0.3～0.4g/L苏氨酸，0.08～0.12g/L天冬酰胺，余量注射水；所述的第二缓冲液的组分包括：2～2.5g/L氯化钾，0.05～0.1g/L磷酸二氢钾，0.1～0.15g/L磷酸氢二钾，37～40g/L肌醇，0.8～1.2g/L葡萄糖，0.3～0.4g/L苏氨酸，0.08～0.12g/L天冬酰胺，余量注射水。4.根据权利要求1所述的真核细胞的电转染方法，其特征在于，所述的电击参数为：150～200v，150～250μs，2次脉冲。5.根据权利要求1所述的真核细胞的电转染方法，其特征在于，步骤(1)中，采用所述的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：于宝利，孙芳，陈旭，陈刚，韩向宗，商春华，牛馨钰，
申请(专利权)人：苏州依科赛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：