一种IBRV病毒的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种IBRV病毒的RPA

【技术实现步骤摘要】
一种IBRV病毒的RPA
‑
CRISPR/Cas12a检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及用于牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）RPA
‑
CRISPR/Cas12a检测的引物组、试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis, IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rbinotracheitis virus，IBRV）引起的一种牛急性接触性传染病，又称“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，临床表现主要为牛体温升高，呼吸困难，鼻黏膜发红，流鼻液，呼吸道黏膜水肿、出血、坏死和形成糜烂。此外，还可引起妊娠牛流产、结膜炎、脑膜炎和乳房炎等多种疾病。IBRV病毒侵入牛体后，可潜伏于一定部位，导致持续性感染，病牛可长期乃至终生带毒，是造成养牛业经济损失的重要原因之一。
[0003]IBRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、a﹣疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirnae）、水痘病毒属（Varicellovirus），学名为牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1, BH1）、坏死性鼻炎病毒和传染性脓疱外阴阴道炎病毒。该病毒可在牛肾、睾丸、肾上腺和胸腺细胞以及猪、羊、马、兔肾细胞和牛胎肾细胞上生长，也可在牛肾传代细胞上培养，并可产生细胞病变，使细胞聚集，出现巨核合胞体，被感染细胞染色后均可见核内包涵体。血清中IBRV的存在会对血清质量、细胞培养、体外试验结果造成严重影响，因此，在胎牛血清中检测该病毒极为重要。
[0004]目前IBRV的检测方法主要有病原学鉴定、血清学试验和聚合酶链式反应（PCR）技术。其中，病原学鉴定及血清学试验耗时长且存在灵敏度低的缺点。因此，需要研究一种高效、灵敏、特异性地检测IBRV检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决活牛、组织或其生物制品中的IBRV的快速检测。为此，本专利技术提出一种用于IBRV检测的CRISPR/Cas12a引物组、试剂盒及其检测方法，能够高效、灵敏、特异性地检测IBRV。
[0006]本专利技术提供一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的crRNA，crRNA选自如下序列之一：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGGCTGCGCGAGGGCGCGCA，SEQ ID NO:11；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGTACACAGCACGTGACGGTAG，SEQ ID NO:12；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUTGAGCGACAGCCACACCTTCGC，SEQ ID NO:13。
[0007]本专利技术另一方面，提供一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的引物组，其特征在于，引物组选自以下5组中的一组或多组：
[0008]本专利技术的另一方面，提供一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的RPA
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CRISPR/Cas12a检测方法，至少包含上述的一个crRNA和至少一个上述的引物组。
[0009]优选的，检测方法中包含以下引物组合与crRNA的组合：引物组合crRNAIBRVA1
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F/IBRVA1
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RcrRNA
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A1IBRVA2
‑
F/IBRVA2
‑
RcrRNA
‑
A1IBRVB3
‑
F/IBRVB3
‑
RcrRNA
‑
B2IBRVBC4
‑
F/IBRVBC4
‑
RcrRNA
‑
B2IBRVBC4
‑
F/IBRVBC4
‑
RcrRNA
‑
C3IBRVA5
‑
F/IBRVA5
‑
RcrRNA
‑
A1优选的，检测方法中包含IBRV A 1
‑
F/ IBRV A 1
‑
R和crRNA
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A1的组合，或IBRV B 3
‑
F/IBRV B 3
‑
R和crRNA
‑
B2的组合。
[0010]根据本专利技术的另一个方面，提出了用于IBRV的CRISPR/Cas12a检测的试剂盒，包括：RPA引物组、核酸扩增试剂、crRNA转录试剂和Cas12a酶。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针，探针为ssDNA，探针的核苷酸序列为5`6
‑
FAM
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
，ssDNA探针的5
’
端标记有6
‑
FAM且3
’
标记有BHQ
‑
1。
[0013]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述探针的两端分别连接荧光基团，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX中的至少一种。
[0014]根据本专利技术的再一个方面，提出了用于IBRV的CRISPR/Cas12a检测的方法，包括以下步骤：S1、提取待检测样本的DNA；S2、使用RPA引物组和核酸扩增试剂对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应，得
到核酸扩增产物；S3、将crRNA、探针和Cas12a酶与步骤S2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应；S4、通过荧光检测确定检测结果。
[0015]进一步的，检测方法包括以下步骤：向RPA反应体系中加入检测样品/靶标模板，充分混匀，分别采用引物组进行RPA反应。
[0016]RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉（2
‑
10mg，优选为4
‑
6mg）的RPA反应管中加入再水化缓冲液、上下游引物、模板、最后再加入醋酸镁溶液，总反应体系可以是10、20、25、50、100μL。
[0017]优选的，反应体系中上下游引物各2μL（2
‑
10μM）、模板2 μL（10
‑3‑
200ng/ul）、醋酸镁溶液2.5μL，再水化缓冲液补足，总反应体系50μL。
[0018]RPA的反应条件为37
‑
42℃条件下，扩增10
‑
30min。优选的，RPA的反应条件为37
‑
40℃条件下，扩增10
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20min，更优选的，反应温度37
‑
38℃，反应时间12
‑
17min。
[0019]Cas12a荧光检测反应体系包括RPA产物、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的crRNA，其特征在于，crRNA选自如下序列之一：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGGCTGCGCGAGGGCGCGCA，SEQ ID NO:11；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGTACACAGCACGTGACGGTAG，SEQ ID NO:12；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUTGAGCGACAGCCACACCTTCGC，SEQ ID NO:13。2.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的引物组，其特征在于，引物组选自以下A
‑
E组中的一组或多组：引物组A，为IBRV A 1
‑
F，如SEQ ID NO:1所示和IBRV A 1
‑
R，如SEQ ID NO:2所示；引物组B，为IBRV A 2
‑
F，如SEQ ID NO:3所示和IBRV A 2
‑
R，如SEQ ID NO:4所示；引物组C，为IBRV B 3
‑
F，如SEQ ID NO:5所示和IBRV B 3
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R，如SEQ ID NO:6所示；引物组D，为IBRV BC 4
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F，如SEQ ID NO:7所示和IBRV BC 4
‑
R，如SEQ ID NO:8所示；引物组E，为IBRV A 5
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F，如SEQ ID NO:9所示和IBRV A 5
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R，如SEQ ID NO:10所示。3.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的RPA
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CRISPR/Cas12a检测方法，其特征在于，至少包含权利要求1中的一个用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的crRNA和至少包含权利要求2中的一个用于牛传染性鼻气管炎病毒IBRV检测的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文峻，李梅，陈刚，陈旭，
申请(专利权)人：苏州依科赛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：